Способ получения рибонуклеазы н из еsснеriснiасоli

ССЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 5377 51) 4 С 12 Х 9/22 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ енное об;ьеПейсениек В 1 осЬеш.,Нцлл.тэ 1.8, 5914-5921.1. Ицс 1. АсЫ 965.РИБОНУКЛЕАЗЫ к биохимии специфиибонуклеополучени и реплика Изобретение отн молекулярной био получению бактер Целью изобретен сит оги к би в ч ных нуклвляетсяпродукт азовы - РНКшение выхода целевазы Н.Экстракт биорацентрифугировфракционированиаммония очищаютхроматографиейрозе и аминоге7,6-7,9 и ионноКС 1. массы подвергают ультанию и надсадок после я осаждением сульфатом от балластных белков на цибакрон-синий-агаксилагарозе при РН й силе 0,045-0,055 МГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(56) Эат 1 з.х 1.Ь. Ецт.1975 э 51 в 369-376.ВетМочет Ь Ье 1 э1,В 3.о 1, Селеш. 1973, 21 тоЬ. Т., ТоыыачаВез.1 1982, 10, 5949(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯИЗ ЕБСНЕК 1 СН 1 А СОЫ(57) Изобретение относитси молекулярной биологии длческой фрагментации РНК ипротеидных компонентов, длрекомбинатных вирусных РН ции плазменных ДНК в присутствииРНК-полимеразы и ДНК-полимеразы Д.Целью изобретения является повышениевыхода целевого продукта и упрощениепроцесса. Способ получения РНК-аэыН включает разрушение биомассы, осветление ниэкосортным центрифугированием, освобождение от внутриклеточныхкомпонентов ультрацентрифугированием,грубое фракпионирование клеточногоэкстракта осаждением сульфатом аммония и очистку хроматографией на цибакрон-синий-агарозе и аминогексилагароэе при рН 7,6-7,9 и ионной силе0 045-0,055 М КС 1, Полученный препарат свободен от примесей постороннихнуклеаэ и пригоден для использованияв молекулярно-биологических исследованиях. Выход целевого продукта повышается по сравнению с известнымспособом в 25 раз, достигая 750 тыс.ед/кг биомассы. 2 табл. В общем виде схема получения выглядит следующим образом: разрушение клеток, осветление - буфер А; ультрацентрифугирование - буфер А; фракционирование сульфатом аммония - буфер А; хроматография на цибакрон-синийагарозе - буфер Б; концентрирование на фосфоцеллюлозе - буфер Б; хроматография на аминогексилагароэе - буфер Б; концентрирование на фосфоцеллюлоэе - буфер Б, где А - 0,05 М трис-НС 1 рН 7,5, 0,01 М МяС 1, 0,25 М КС 1, О, 1 мМ ДТТ, О, 1 мМ ЭДТА, 5 Ж глицерина; Б - 0,02 М трис-НС 1 рН 7,9, Э 1495377О, 1 мМ ДТТ, О, 1 мМ ЭДТА, 0,05 М КС 1,5% глицерина,Схема выделения позволяет заметносократить по сравнению с известнымспособом затраты времени и реактивови увеличить выход целевого продуктав 25 раз. Сокращение времени достигается за счет ультрацентрифугирования,уменьшения числа и упрощения хроматографических стадий. Увеличение выхода обеспечивается использованием биоспецифических сорбентов, ранее не использовавшихся для выделения РНКазыН, Хроматография на цибакрон-синийагарозе при рН 7,6-7,9 позволяет водну стадию освободиться от большойчасти балластных клеточных белкови добиться сильного обогащения целевым продуктом практически без потерь 20последнего. Хроматография на аминогексилагарозе при ионной силе 0,0450,055 М НС 1 и рН 7,6-7,9 обеспечива"ет окончательную очистку от примесныхнуклеаз. Число хроматографических 25стадий снижается с пяти до двух, количество используемых буферных растворов - с б до 2.Выход целевого продукта, пригодного для использования в молекулярной биологии, увеличивается с 30,5до 750 тыс. ед/кг биомассы.П р и м е р 1. 1,0 кг замороженных клеток Е. со 11 МРЕ 600 суспендируют в ровном объеме буфера А и разрушают в дезинтеграторе Мантона-Гаулина 15 М-БТА при давлении 500-600 атмсуспензию разбавляют буферным раствором до 15 л,добавляют 0,2 мг ДНКазы(свободной от рибонуклеаз) и перемешивают 30 мин.Клеточные осколки удаляют центрифугированием на центрифуге в ротореяБА 30 мин при 12000 об/мин.Рибосомы удаляют ультрацентрифуги рованием на центрифуге "ВесКшап 1550" в зональном роторе Тч при28000 об/мин.К супернатанту (1500 мл) добавля"ют сухой аммоний сернокислый из расчета 22 г на каждые 100 мл суперна 50танта. При этом добавляют сухой(трис)-оксиметиламинометан, поддерживая рН 7,8, Образовавшийся осадокудаляют центрифугированием на центри55Фуге в роторе КБЗ 30 мин, при7000 об/мин. К прозрачному супернатанту добавляют еще 14 г аммониясернокислого на каждые 100 мл раствора. Осадок собирают центрифугиройанием на центрифуге и растворяют в минимальном объеме буфера В, Раствор диализуют против буфера В. Выпавший осадок удаляют центрифугированием на центрифуге в роторе цБЛ 30 мин при 12000 об/мин.Осветленный раствор наносят на колонку с цибакрон-синий-агароза (уравновешенный буфером В, объем колонки 400 мл, диаметр 2,6 см, длина 75,5 см) со скоростью 100 мл/ч. Колонку промывают 1 л буфера В, после чего подключают градиент концентрации КС 1 (0,05-0,7 М) в буфере В. Во фракциях градиента проверяют активность рибонуклеазы Н и Фракции с максимальной активностью Фермента объединяют и концентрируют на колонке с фосфоцеллюлозой (объем 10 мл), Концентрированный Фермент с Фосфоцеллюлозы элюируют в буфере В, содержащем 1 М хлористый калий, и диализуют против буфера В.Отдиализированный материал наносят на колонку с аминогексилагарозой (уравновешенной в буфере В, объем колонки 500 мл, диаметр 2,6 см, длина 94,5 см) со скоростью 200 мл/ч. Колонку промывают буфером В. Во Фракциях элюата проверяют активность рибонуклеазы Н и побочных рибонуклеаз. Фракции, содержащие Ферменты без побочных активностей, объединяют и консервируют добавлением глицерина до конечной концентрации 50%.Выход 750 тыс, ед удельная активность 400 тыс. ед/мг белка, Препарат проверяют на следовые примеси ферментных активностей дезоксирибонуклеаз, рибонуклеаз, рибонуклеазы 111, Перечисленные Ферментативные активности отсутствуют,За единицу активности принимаются количество фермента, катализирующеел образование 1 мкмолькислоторастворимых нуклеотидов за 20 мин при 37 С с использованием в качестве субстрата (С 14) поли (хА), поли (й).Влияние изменений рН на выход целевого продукта в предельных (примеры 2 и 3) и запредельных (примеры 4 и 5) значениях показано в табл.1; изменение выходов РНКазы Н в зависимости от ионной силы на стадии очистки на аминогексилагарозе - в табл.2,1495377 Формула изобретения Таблица 1 рН Ионная Выход,Примеси побочных рибонуксила, леаз,дизоксирибонуклеаз и Ы КС 1 рибонуклеазы 111 Пример 100,0 90,0 98,5 15,0 85,5 Отсутствуют 7,8 0,05 7,96 0,05 7,9 0,05 7,4 0,05 8,0 0,05 1 2 3 4 5 111 11 Таблица 2 рН Примеси побочных рибонуклеаз,дезоксирибонуклеаз,и рибонуклеазы 111 При- Ионная Выход,мер сила,М КС 1 7,8 7,8 7,8 7,8 7,8 100 30 77 5 700,050 0,045 0,055 0,035 0,060 Составитель Н.ХодаревТехред М,дидык Корректор М.Самборская Редактор Н.Гунько Заказ 4216/25 Тираж 500 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рауюская наб д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 Способ получения рибонуклеазы Н из ЕзсЬегхсЬа со 11, включающий дезинтеграцию биомассы, получение экстракта отделением клеточного дебриса низкоскоростным центрифугированием, фракционирование экстракта сульфатом аммония, очистку хроматографией и концентрирование на фосфоцеллюлозе, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с ц:лью повыщения выхода целевого продукта и упрощение процесса,экстракт подвергают ультрацентрифу гированию, фракционируют надосадоксульфатом аммония, диализуют противстартового буфера для цибакрон-синийагарозы с последующей хроматографической очисткой на цибакрон-синий агарозе и аминогексилагарозе при рН7,6-7,9 и ионной силе 0,045-0,055 Мхлористого калия.