Способ выделения цитохрома

ОПЙСАЛИЕИЗОБРЕТЕНИЯ,К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ нц 654612(51) М, Кл. С 07 С 103/52 Государственный комитет СССР по делам нзобретеннй н атнрытнй(088.8) Дата опубликования описания 300379Московский технологический институт мясной и молочной промышленности(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦИТОХРОИА С Изобретение относится к улучшенному способу выделения цитохрома С биологически активного соединения, который может найти применение в медицине для лечения различных нарушений окислительных процессов в организме. Известный способ выделения цито хрома С 1) состоит в кислой экстракции (трихлоруксусной кислотой) сердец крупного рогатого скота, отделении балластных белков сульфатом аммония, осаждении цитохрома С раство ром трихлоруксусной кислоты, очистке от примесей насыщенным раствором сульфата аммония, диализе водного раствора продукта, деминерализации раствора цитохрома С с помощью катионита Ю СДВ-ЗТ и анионита ЭДЭП и, наконец, лиофильной сушке. Основные недостатки известного метода состоят в том, что циализ продолжается в течение 2-3 суток, при этом потери цитохрома С 25 составляют до 25; кроме того, весь процесс выделения состоит из большсго количества технологических операций, общая продолжительность которых составляет 120 ч. ЗО Цель настоящего изобретения - повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса.Поставленная цель достигается опи" сываемым способом выделения цитохрома С из сердец крупного рогатого скота, заключающимся в том, что сердца крупного рогатого скота экстрагируют трихлоруксусной кислотой, от экстракта отделяют балластные белки обработ" кой сульфатом аммония, затем полученный экстракт обрабатывают макропористым сульфокатионитом, содержащим дивинилбензол в пределах 15-100, с последующим элюированием раствором хлористого натрия или ацетатным буфером при рН 5,8, после чего проводят деминерализацию электродиализом с использованием ионообменных мембран. Отличительными признаками способа являются обработка экстракта после отделения балластных белков макропористым сульфокатионитом, содержащим дивинилбензол в пределах 15-100, последующее элюирование раствором хлористого натрия или ацетатным буфером при рН 5,8 и проведение деминерализации элюата электродиализом с Оспользованием ионообменных мембран.,8 ержа- проно 50 5 Предпочтительными вариантами способа являются многократная (преимущественно двухкратная) сорбция цитохрома С с помощью макропористых сульфокатионитов и осуществление электродиализа в течение 4-6 ч при плотноститока 1-2 А/дм.Применение описываемого способавыделения цитохрома С из сердец крупного рогатого скота позволяет сократить время пронедения процесса со 120до 60 ч и повысить выход целевогопродукта на л"8,П р и м е р 1, Свежие сердцакрупного рогатого скота дефростируют,измельчают, промывают водой для удаления крови, а затем экстрагируют 152,5-ной трихлоруксусной кислотой Выход цитохрома С в этом опыте составил 62 от условного содния в экстракте. В результатеведения 10 опытов было получе10 фракций с содержанием цитохрома С 1,4 мг/мл. Объединенные фракции (100 мл) подвергают повторной хроматографической очистке на колонке (10 х 200 мм), Для этого макропорис тый катионит КУ30/100 предварительно переводят в Н-форму, последовательно промывают 1 н. раствором ИаОН -Н О вн. раствором НС 1-ф Н О,2 2 Параметры ионообмена аналогичны описанным . В результате получено 25 мл раствора, имеющего следующие:характеристики: концентрация цитохрома С 4,5 мг/мл, концентрация (ИН 4)2 804 2,4 г-экв/л. Потери составляют 20, выход 80. Таким образом, общий вы 2 4течение 2 ч. Для экстракции на 1 вес.ч. фарша берут 1 объем зкстрагента, Перед осаждением балластных белков рН в экстракте устанавливают 7,0-7,2. Балластные белки отделяют при добавлении 550 г (НН 4)2 БО на 1 л жидкости, Для хроматографического отделения цитохрома С используют колонку 10 х 200 мм, в которую загружают 10,0+0,1 г (в пересчете на сухое вещество) макропористого катионита КУ30/100, Скорость пропускания исходного раствора и элюента 2 мл/см мин, через колонку пропускагют 150 мл экстракта, оснобожденного от белков. Цитохром злиируют 0,55 М раствором ИаСГ (40 мл) . Параметры ионообмена приведены в табл.1.Таблица 1 ход цитохрома после 2-кратной очистки на сульфокатионите составил 50. Полученную фракцию цитохрома С подвергают деминерализации в аппарате АО, предназначенном для обессолинания биологических жидкостей. Объем рабочей камеры 5 мл, электроды платиновые. В аппарате используют ионообменные мембраны ИАи МКс рабочей поверхностью 5,5 см. Мембраны предварительно переводят в рабочую форму и приводят в равновесие с раствором цитохрома С. В качестне каталита используют 0,2 н. раствор ИаОН, а аналита - 0,02 н. раствор Н ЯО . Де 2 4 минерализацию пронодят в течение 4 ч при плотности тока 2,0 А/дм. В резульате концентрация (ИН 4) Б 04 снижается до 0,1 г-экв/л, Потери цитохрома С на этой стадии составляют 15. Получен654612 в примере 1. Потери цитохрома С наэтой стадии составляют 12. Общий выход цитохрома С по предлагаемой схе 550ме выделениЯ 44, ,во"=0,96 5ЕокислП р и м е р 3. Подготовку сырья,экстракцию и удаление балластных белков проводят по методике, описаннойв примере 1. В качестве сорбента используют сульфокатионит, полученныйн результате полимеризации дивинилбензола, КУ=23 100/100 в количестве 10,0+0,1 г (в пересчете на сухоевещество). В качестве элюента используют ацетатный буфер с рН 5,8. Параметры 2-кратного ионообмена на данной смоле аналогичны параметрам, описанным в примерах 1 и 2, Выход цитохрома С равен 55. Электродиализ проводят при параметрах, описанных в примерах, 1 и 2. Выход на этой стадии85, Общий выход цитохрома С по предТаблица 2 Элю од 550васстшваокисл лагаемой схеме т( О дистиллрованная 2 О,0,55 М раст14 аСЯ 3 56 6 атный буРН 5,8 2 7/ фе Выход и чистот цитохрома С по схеме противопоставляемого метода (после очистки насыценным раствором (йП 4) ВО 1 4 0,8; О,изобретен о 50 одным или аце деминевора элеконооб 5 ный раствор подвергают лиофильной сушке . Идентификацию и количественное определение осущестнляют спектроФотометрическим методом. Общий выходЕ 560 цитохрома С 42,5, - т: 0,9.нос стс гвоокислП р и м е р 2. Подготовку сырья, экстракцию и удаление балластных белков проводят по методике, описанной в примере 1, В качестве сорбента ис - пользуют макропористый сульфокатионит КУ=23 40/100 в количестве 10,0 + +0,1 г (в пересчете на сухое вещество), Параметры ионообмена в данном случае аналогичны параметрам, описанным в примере 1, Кроме того, для данной смолы исследовали влияние различных видов элюента на процесс десорбции (табл.2). В данном примере оптимальные результаты (учитывая степень чистоты и выход) получают при использовании в качестве элюента раствора МаСГПовторное хроматографирование объединенных фракций, содержаших 3,3 мг/мл цитохрома С, на катионите КУ=23 40/100 позволило получить Фракцию цитохрома С, которая имеет следующие характеристики: концентрация цитохрома 5,0 мг/мл, концентрация (ИН ) ЯО 2,3 г-экв/л. Общий выход цитохрома С после 2-кратной хроматографической очистки составил 50, Полученный раствор цитохрома С подвергают деминерализации в аппарате АОс помощью ионообменных мембран ИА=40 и МК=40. Параметры ионообмена аналогичны параметрам, приведенным 0 5 0 4555047вассг2 воокислП р и м е р 4, Подготовку сырья, экстракцию и удаление балластных белков проводят по методике, описанной в примере 1. В качестве сорбента используют сульфокатионит КУ15/100.Параметры сорбции и десорбции аналогичны примерам 1,2,3. В качестне элюента используют ацетатный буфер с рН 5,8. Катионит КУ15/100 применяют в Н-, Иа- и 14 Н 4- формах. Ионообмен проводят двухкратно. Наибольший выход цитохрома С (21) получен при использовании ИН - формы. Условия электро 4диализа и выход цитохрома С аналогичны описанным н примере 1 и 2.Общий ныход гемопротеида с использованием данного катионита 17,55 с/ВосстЕ 2 воокисл хрома Сскота пу- ихлорук- балласт- инерализал и ч алью увепроцесса,отделениявают максодержах 15-100,Способ выделения цитоердец крупного рогатого тем экстракции последних тр сусной кислотой, отделения ных белков, последующей дем ции и лиофильной сушки, о т ю щ и й с я тем, что, с це личения выхода и упрощения экстракт, полученный после балластных белков, обрабаты ропористым сульфокатионитом щим дивинилбензол в предела с последующим элюиронанием раствором хлористого натрия татным буфером при рН 5,8 и рализацией полученного раст тролизом с использованием и менных мембран2, Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что сорбцию с помощью макропористого сульфокатионита проводят двухкратно.3. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что электродиалиэ 654612осуществляют в течение -6 ч приплотности тока 1-2 А/дм.Источники информации, принятые вовнимание при экспертиэе1. Авторское свидетельство СССРР 351546, кл. А 61 К 35/34, 171.Закаэ 2305/215 филиал ППП ффПатент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Составитель В. Волкова Редактор В, Иинасбекова ТехредЛ Алферова Корректор А, Гриценко Тираж 512 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам иэобретений и открытий 113035 Иосква ЖРаушская наб. д, 4/5