Способ извлечения белковых веществ из растворов

11 533631 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(45) Дата опубликования описания 19.11.76 51) Ч.К 1:Р С 12 О 13/06 С 07 6 7028Государственный комитет Совета Министров СССР 1 од)Д 1; 637 ю 27,3(088.8) ло делам изобретений и открытий(71) Заявитель Ордена Ленина институт элементоорганических соединенийАН СССР(54) СПОСОБ ИЗВЛЕЧЕНИЯ БЕЛКОВЫХ ВЕ 1 ЦЕСТВ ИЗ РАСТВОРОВИзобретение относится к микробиологической промышленности, точнее к способам извлечения белковых веществ из биологических источников, их экстрактов, гомогенатов и из белковых растворов,Известны различные способы извлечения и очистки белковых веществ из экстрактов и гомогенатов биологических источников, Так, известен способ иммобилизации ферментов, заключающийся в том, что белок физически адсорбируется на нерастворимом в воде носителе и таким образом переходит в нерастворимую форму. Ц Физическая адсорбция при ттомощи сил Ван-дер-Ваальса (например, па активированном угле) или при помощи сил Кулона (на ионообменниках) относится к стареКшим методам иммобилизации. Для выделения индивидуальных белков и их фракций в ряде случаев используют обратимую иммобилизацию белка или белков определенного класса на нерастворимом носителе. 2), 3 Преимущество этого пути состоит в том, что при его реализации используются не физические свойства белков, зависящие от их индивидуальных особенностей и от природы сопровождающих примесей, а наличие в белках определенных функциональных групп, характерных для химических сое- динениК белковой природы. В частности к таким группам относятся сульфгидрцльныс 5 Н-группы.Наиболее близким аналогом является способ разделения белков со свободнымц сульф гидрильными группами от белков, у которыхтакие группы отсутствуют, путем иммобилизации содержащих 5 Н-группы белков на ртуть-органическом носителе на основе поли- сахаридноК матрицы. 410 При введении раствора белков в контактс этим носителем содержащие сульфгпдрцльные группы иммобилизуются на носителе в результате образования ртуть-меркаптцдных связей, после чего носитель с цммобилизовап ными белками промывают буферными ц водносолевыми растворами для удаления нецммобилизовавшихся веществ, а затем обрабатывают носитель раствором ццстеина, восстанавливающего ртуть-меркаптцдные связи, для 20 деиммобилизациц белков.Недостатками указанного способа являются извлечение лишь белков, содержащих свооодные сульфгидрильные группы, относительное количество которых в суммарных 25 белковых веществах источника может бытьмало; расщепление под действием цистеина не только ртуть-меркаптидных связей, но и связей ртуть-носитель, в результате чего элю- ируемыК с носителя белок содержит примеси 30 ртуть-органических соединений, обладающих50 Предлагаемый способ извлечения суммарных белковых веществ согласно изобретению обеспечивает высокий выход белка, не приводит к загрязнению извлекаемых белков токсичными примесями и является универ сальным, т. е. не зависит от вида источникабелковых веществ и от природы сопровождающих примесей. Схема способа проста, не требует разработки нового технологического оборудования, причем одна и та же техноло гическая схема практически без перестройкии переналадки может использоваться для извлечения белков из различных источников, что позволяет варьировать загрузку производственных мощностей при переработке се 65 зонных видов сырья. 3высокой токсичностью, Кроме того, в зависимости от источника извлекаемых белков в исходном растворе может содержаться разли гное количество низкомолекулярных тиолсодеряащих соединений.Целью предлагаемого изобретения является разработка такого способа извлечения суммарных белковых веществ из биологических источников, их экстрактов, гомогенатоз и нз белковых растворов, которын не содержал бы указанных выше недосаков, не зависел Оы от приооды источника белла и позволил бы извлекать белковые вещества с высоким выходом,оставленная цель достигается тем, что перед пммобилизацией в раствор белковых веществ вводят восстанавливающий дисульфидные связи агент, например меркаптоэтанол, натрийборгидрид, дитиотрептол, цистеин и др после чего удаляют избыток восстанавливающего агента, а иммобилизацию белковьх веществ осущестзляют на носителе, содержащем Я - Я связи, При этом промывку носителя можно проводить водносолевыми, органическими, водноорганическими растворител ми.В зависимости от выбора биологичеокого ,источника, а также для увеличения выхода белка целесообразно в раствор белковых веществ вводить агент, способствующий разворачивачию полипептидных цепей белковых веществ, например додецилсульфат натрия, мочевину, гуанидин-гидрохлорид и т. и.П р и м е р 1, Пекарские дрожжи замораяизают з дистиллированной воде и дезинтегрируют в прессе Хьюза. Дезинтегратор оттаивают, суспензию центрифугируют при 5000 об/мин, супернатант отбирают и лиофи-. лизуют.75 мг лиофилизованного супернатанта растворяют в 5 мл буферного раствора (0,1 М трис/НС 1, рН 8,0), содержание белковых веществ в растворе по данным биуретозой реакции составляет 30,3 мг, Раствор 15 мин продувают током аргона, добавляя для гашения пены 2 - 3 капли этанола, затем вносят 50 мкл 2-меркаптоэтанола и инкубируют смесь 30 мин. Добавляют еще 50 мкл 2-меркаптоэтанола и инкубируют еще 30 мин. Затем раствор наносят на колонку (15 Х 400 мм), заполненную Сефадексом Г, уравновешенным буфером, и элюируют со скоростью 40 мл/час тем же буфером, Отбирают фракцию элюата, содержащую высокомолекулярные вещества. Содержание белковых веществ в этой фракции по данным биуретовой реакции составляет 24,6 мг. Фракцию помещают в сосуд с мешалкой и добавляют навеску носителя для дисульфидно-обменной козалентной хроматографии из расчета 1,5 мкМ 5 - Я- групп носителя на 1 мг белка, Суспензию перемешивают 6 час при комнатной температуре. Твердую фазу отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 3500 об/мин, про 5 0 5 20 25 Зо 35 40 45 мывают буфером (ЗМ 50 мл), дистиллированной водой (ЗУ 50 мм), 50(,-ным водным раствором этанола (50 мл), дистиллированной водой (Зх 50 мл) и буфером (Зх 50 мл). П.омывные воды отбрасываю, носиель сусгендируют в 4 мл буфера, добавляют 0,2 мл 2- меркаптоэтанола и перемешивают 6 час при комнатной температуре. Твердую фазу отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 3500 об/мин, вновь суспендируют в 4 мл буфера, перемешивают 1 час и вновь отделяют твердую фазу. Объединенную жидкую фазу лиофилизуют. Выход белка составляет 45,4, Продукт характеризуется отсутствием цвета, вкуса и запаха, хорошо растворяется в воде.П р и мер 2. 70 мг сухого изолята океанского криля растворяют в 5 мл буфера (0,1 М трис/НС, 0,15 М додецилсульсрата натрия, рН 7,о). Содержание белковыхвеществ в растворе по данным биуретовой реакции составляет 44,1 мг, Раствор подвергают обработке, описанной в примере 1, с тем отличием, что раствор деиммобилизованных белков, отделенный от твердой фазы носителя, не подвергают сушке, а наносят на колонку (15 Х 400 мм), заполненную Сефадексом Ги элоируют дистиллированной водой. Фракцию элюата, содержащую высокомолекулярные вещества, лиофилизуют, растворяют в 10 мл 0,1 М СНСООН и со скоростью 10 мл/час пропускают через колонку, заполненную анионообменной смолой Дауэкс 2 х 10 (200 - 400 меш ОЛс-форма), для освобождения раствора от примеси додецилсульфата натрия. Злюат лиофилизуют, Вес белкового изолята составляет 40,2 мг, что соответствует выходу белка 91,3%.П р и м е р 3. 75 мг лиофилизованного супернатанта дезинтеграта пекарских дрожжей растворяют в 5 мл буферного раствора (0,1 М трис/11 С, 0,15 моль/л додецилсульфата натрия, рН 8,0). Содержание белковых веществ в растворе по данным биуретовой реакции составляет 30,3 мг. Раствор подвергают обработке, описанной в примере 2. Выход белка составляет 78/,533631 Формула изобретения Составитель М. ЛаринаТекред В, Рыбакова Редактор Е. Дайч Корвсктор И. Сик 1 кнна Заказ 954/1468 Изд,1731 Тирак 575 Подписное ЦНИИП 1 Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, 1 К-З 5, Раушска, наб., д. 4/5Тип. Харьк. фил. пред. Патент. 1. Способ извлечения белковых веществ из растворов путем иммобилизаци на нерастворимом носителе с последующей промывкой носителя и удалением белковых веществ с него, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода .белковых веществ перед иммооилизацией в раствор белковых веществ вводят восстанавливающий дисульфидные связи агент, например меркаптоэтанол, после чего удаляют избыток восстанавливающего агента, а иммобилизацию белковых веществ осуществляют на носителе, содержащем Я - Я связи.2. Способ по п. 1, отличающийся тем,что промывку носителя ведут водно-солевыми и/или органическими и/или водно-органическими растворителями. 5 3. Способ по п. 1, отличающийсятем, что в раствор белковых веществ вводятагент, способствующий разворачиванию полипептпдных цепей белковых веществ, например додецилсульфат натрия.1 О Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:111. Способы получения пммобплизовапных ферментов и их применение в пищевойпромышленности, ЦНИИТЭИПищепром, М.,1 о 1973,Я В 1 осЬегп 1. 133/3/, 573 - 584, 1973 г.