Способ выделения никотинамидадениндинуклеотид глутаматдегидрогеназы из хлореллы

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветсиикСоциалистическихРеспубими 958502(51) М. Кл. С 12 й 9/06 С 12 й 1/12 Ьвударстюай каюктвт СССР в делам язабретавий и еткрытийОпубликовано 15,09.82. Бюллетень ЭВ 34 Дата опубликования описания 15.09,82 4 % гщ(71) Заявитель Ордена Ленина институт биохимии им, А, Н. Баха(54) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ХЛОРЕЛЛЫ 1Изобретение относится к биохимии, а именно к способам получения ферментов из ра тительного сырья, и может быть использовано для научных целей и в ферментной промышленности,5Известен способ выделения пикотинамидаде. ниндинуклеотндглутаматдегидрогеназы (НАД(Ф) - ГДГ) из термофильного штамма хлореллы - С 111 оге 11 а Ругеподоза 82 Т: путем разрушения клеток в фосфатном буфере на деэинтеграторе, ультрацентрифутнрования с отбрасыванием осадка, удаления балластных ве. ществ обработкой надосадочной жидкости стрел. томицинсульфатом с последующим концентрированием ферментсодержашего раствора высаливанием сульфатом аммония до 52 - 60% степени насыщения и обессоливанием на Сефадексе, ионообмейной хроматографии на диэтиламинозтилцеллюлоэе с элюцией фосфатным буфером рН 7,0-7,4 с последувлцей гель-фильтрацией го полученного элюата на Сефадексе 6-200, сорбцн. ей на геле фосфата кальция и высаливания сульфатом аммония. Через 1,5 - 2 недели с момента разрушения клеток в результате высалявания выпадает мелкодисперсный осадок, где сосредоточена вся активность НАД(Ф) -ГДГ Г 1 н (21,Однако известный способ является длительным и при его осуществлении получают небольшой выход фермента (29%), обладающего не. достаточной активностью (230 - 250 Ед) и чисто той (степень очистки 740).Цель изобретения - ускорение процесса, повышение выхода и качества целевого продукта.Поставленная цель достигается тем, что согласно .способу выделения НАД(ф) - ГДГ иэ хлореллы путем разрушения клеток в фосфатном буфере, выделения бесклеточного экстракта, осаждения из него балластных веществ н удаления осадка центрифугнрованием с после. дующим концентрированием супернатанта осаждением сернокислым аммонием до 50 - 52% степени насыщения и обессоливанием на Сефадексе, хроматографии ферментсодержащей фракции на полисахарндном сорбенте с, злюцней фос. фатным буфером рН 7,0 - 7,4, содержащим 1 ЧаС 1, н фракционирования ее на геле фосфата кальция. осажцение балластных веществ прово. пят нагреванием бесклеточного экстракта вОбщий белок,мг Общая ак- Удельная ак- Степень Выход,тивность, Е тивность, очистки % Е/мг белка Стадии очистки 0,46 100 10395 Исходный экстракт Нагревание 5 минпри 60 - 65 С 2,8 1,32 4166 3150 Обработка МпС 1 3520 126 73 60 Фрак ционированиена геле фосфатакальция 820 2137 382 5,6 ФХроматография наАГ - Сефарозе 4 В 1872 440 956 39 4,2 Рехроматография наАГ - Сефарозе 4 В 1800 510 1097 37 3,5 3 958502 течение 5 - 10 мин лри 60 - 65 фС, в полученный супернатант добавляют МпС 1 з до конечной концентрации его в супернатанте 0,015-0,030 М с последующим элюированием фермента с образовавшегося осадка буфером, причем фракцио. нирование на геле фосфата кальция проводят после обработки, сульфатом аммония и обессоливания с последующей двукратной хромато. графией элюата с использованием в качестве полисахаридного сорбента аминогексил - Сефарозы 0 и злюцией фермента линейным градиентом.йаС 1 в пределах 0-0,10 М,В предлагаемом способе по сравнению спрототипом сокращается время выделения . дфермента с 20 до дней, увеличивается выходцелевого продукта, а также повышается активность выделенного фермента в 2 раза,П р и м е р, 250.г. влажной клеточнойпасты термофильного штамма хлореллы суспен-дируют в равном объеме 0,07 М фосфатногобуфера рН 7,4, .содержащего 1 мМ меркаптоэтанол. Разрушение суспензии клеток осуществляют в гомогениэаторе Лтипа планетарнаямельница 12).2После разрушения клеток гомогенат разбавля-.ют исходным буфером и центрифугируют сначала при 6000 хц, а затем при 30000 хд в течение 30 мин. В результате получают 770 мл бесклеточного экстракта, который прогревают5 мин при 60 - 65 фС и осадок денатурированныхбелков удаляют центрифугированием,К охлажденной до 15 С надесадочйой жидкостипри интенсивном перемешивании добавляют покаплям 1 М МпС 1 г (из расчета 3 мл 1 ММпС 1 на 100 мл бесклеточного экстракта). Зф. В этих условиях в течение 30 мин образуется 4осадок фосфата марганца и происходит адсорбция на нем НАД(Ф) - ГДГ. Образовавшийсяосадок собирают центрифугированием при8000 хц в течение 0 мин.Элюцию фермента с осадка осуществляют0,20 М фосфатным буфером рН 7,4 два разапорциями по 160 мл. Объединенный элюатконцентрируют высаливанием сернокислымаммонием до 52% насьпцения с последующимобессоливанием на колонке с Сефадексом (3-25,К 60 мл сконцентрированной и обессоленнойфракции добавляют гель фосфата кальция (израсчета 2 мг геля на 1 мг белка), Осадок отделяют центрифугированием, а фермент элюируют с геля 0,20 М фосфатным буферомрН 7,4, Активную фракцию концентрируютвысаливанием сернокислым аммонием до 52%насьпцения с последующим обессоливаниемна. колонке с Сефадексом 6 - 25.Обессоленную фракцию помещают на колонку с АГ - Сефарозой 4 В,уравновешенную старто-:вым 0,005 М фосфатным буфером рН 7,0.Элюцию фермента с колонки осуществляютлинейным градиентом йаС 1 0 - 0,10 М в стартовом буфере, Активный элюат концентрируютпутем ультрафильтрации через мембрану "Амикон" ХМи подвергают рехроматографии наколонке с АГ - Сефарозой 4 В, В результатеполучают гомогенный препарат с удельной активностью 510 Е/мг белка,Результаты очистки (НАД(Ф) . глутаматдегидрогеназы СЬ 1 оге 11 а ругеподоза 82 Т представлены в таблице,Технико - экономическая эффективность пред.лагаемого изобретения состоит в ускорении про.цесса, улучшейи качества и повышении выходаполучаемого продукта.Составитель О, СкородумоваТехред Т. Фанта Корректор Г Огар Редактор М, Келемеш Заказ 6983/37 Тираж 505 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 45Поднисное Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 5 95850Формула изобретения Способ выделения ннкотинамидадениндинук. леотнд- глутаматдегидрогеназы нз хлореллы путем разрушения клеток в фосфатном буфере, ч выделения бесклеточного экстракта, осаждения иэ него балластных веществ и удаления осадка центрнфугированием с последующим концентрированием супернатанта осаждением сернокислым. аммонием до 50 - 52% степени насыщения 1 ф и обессоливанием на Сефздексе, хроматогра.фин ферментсодержзщей фракции на лолисахаридном сорбенте с элюцией фосфатным буфе.ром рН.7,0 - 7,4, содержащим МзС 1, и фракционирования ее на геле фосфата кальция, о т% л и ч а ю щ и й с я тем; что, с целью ускорения процесса, повышения выхода и качествацелевого продукта, осаждение балластных веществ проводят нагреванием бесклеточного экстракта в течение 5 - 10 мнн при 60-65 ьС, в полученный супернатант добавляют МпС 1 2 Ьдо конечной концентрации его в супернатанте0,015-0,030 М, элюированием фермента с об.разовавшегося осадка буфером, причем фрак.ционнрование на геле фосфата кзльция проводят после обработки сульфатом аммония иобессоливания с последующей двукратной хроматографией элюага с использованием в качествесорбента аминогекскп - Сефарозы и элюциейфермента линейным градиентом МаС 1 в пределах 0 - 0,1 М в буфере. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Лосева Л. П Шатилов В. Р., СофьииА.В.,Кретович В, Л. Молекулярный вес и субъеднннчная природа конститутивной НАД(ф) - глутаматдегидрогеназы хлореллы. ДАН СССР, Т,232,1977, Мф 3, с. 703-705,2. Рзшба Е. Я. и др, Дезинтеграция микро.организмов. Материалы Всесоюзной конференции, Пущино-на-Оке, 1972, с. 159,"