Способ выделения белка

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 2 17 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АВТОРСНО ЕТЕЛЬСТ ЬНескои хими оленко,ченок ге М. Ап ипе 1 зо 1 аг 1 опоЬц 11 п агоюС 1 п. СЬнп.03-111.е 1 пег гурепзцепи айаг с 1 езс 1 еп С 1 оЬц 11 п1 сцзз 1 гцп 8.Л,1979,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(71) Институт биоорганиАН Белорусской ССР(56) 1.Кааес 1 а 1 В.,Ка 11 Ьерабочей ргосес 1 цге Гог гЬоЕ гЬгох 1 пе-Ьпс 11 пд 81Ьцшап ргеепапсу зегцш.Асса, 1977, ч. 78, р. 12.Ресе 1 с И. ЯасЬмегзрех 1 Г 1 зсЬеп М 11 сгоегегоЬцшапеп ТЬдгохгп-Ь 1 пдепс 1 цгсЬ 1 зое 1 е 1 ггхзсЬе РоС 11 п. СНЕМ.С 11 п.В 1 осЬешч 17 9 ЯО ис 504 С 07 К 7/00 С 01 Я 33(54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКА,СВЯЗЫВАЮЩЕГО ТИРОКСИН, из сывороткиретроплацентарной крови путем аффинной хроматографии с использованием в качестве сорбента эпоксисефарозной матрицы с присоединенным лигандом - тироксином, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения выхода выделяемого белка иупрощения процесса, в качестве эпоксисефарозной матрицы используют сефарозу, активированную эпихлоргидрином, а элюцию белка с сорбентаосуществляют щелочью при рН 9,3-12,9328Изобретение относится к области биохимии и медицины, конкретно к выделению белка, связывающего тироксин, который может быть использован в качестве ингредиента радиодиагнос-, тических наборов для определения . тироксина.Известен способ выделения белка, связывающего тироксин, заключающийся в обработке разбавленной водой в со отношении 2:1 сыворотки ретроплацентарной крови гидроксиапатитом, центрифугировании и аффинной хроматографии супернатанта на сорбенте, представляющем собой сефарозу, активи . рованную 1,4-бис(2,3-эпоксипропокси)бутаном (эпоксиактивированная сефароза) с присоединенным лигандом - тироксином с последующей элюцией 2 шМ 8-анилинонафталиносульфо кислотой (АБЯ). Иэ литра сыворотки получено 13-15 мг белка, связывающего тироксин, что составляет 22 241 1 .Недостатками способа являются 25 низкий выход белка, связывающего тироксин, и необходимость обработки сыворотки гидроксиапатитом, что усложняет процедуру выделения.Целью изобретения является новы шение выхода белка, связывающего тироксин, а также упрощение процесса.Поставленная цель достигается тем, что в качестве эпоксисефарозной матрицы используют сефарозу активированную эпихлоргидрином, а элюцию белка с сорбента осуществляют щелочью при рН 9,3-12.Используемый сорбент вследствие своей структуры обеспечивает более селективное извлечение выделяемого белка и, как следствие, более высокий выход.В сорбенте, используемом в способе - прототипе более длинная по ф сравнению с предложенным сорбентом гидрофобная "ножка", соединяющая лиганд с матрицей - остаток 1,4- -бис(2,3-эпоксипропокси)бутана. Это оказывает существенное влияние на процесс сорбции. За счет гидрофобных взаимодействий возможна сорбция других белков, которые загрязняют аф. - финный элюат, что препятствует сорбции тироксин-связывающего белка и ээ снижает его выход.Соотношение объемов сыворотки крови и аффинного сорбента при опреде 17 2ленной концентрации конъюгированноготироксина подбирается эмпирически.Оптимальная концентрация иммобилизованного тироксина в полученной сус 3 -4пензии 510 - 1 10 мол/л. Влияниеобъема аффинного сорбента при постоянном объеме сыворотки крови (1 л)на выход целевого продукта приведенов таблице./Элюция целевого продукта щелочьюпо сравнению с элюцией 8-анилинонафталиносульфокислотой позволяетполучить свободный от лиганда белок,тогда как при элюции 8-анилинонафталиносульфокислотой необходима очистка целевого продукта от элюента.Указанный интервал значений рНпри элюции определяется, с одной стороны, точкой ионизации гидроксильнойгруппы тироксина, а с другой - возможностью инактивации белка в сильнощелочной среде.П р и м е р 1. Синтез аффинного.сорбента.100 мл сефарозы 4 В (РЬагшасаРые сЬешдса 1 з,. Швеция) промывают нафильтре 1 л 0,5 М БаС 1 и 1 л воды.К влажному гелю прибавляют 80 мл 1 МИаОН,и 10 мл эпихлоргидрина. Смесьперемешивают 2.ч при температуре37 С. Избыток реагентов отмывают последовательно водой (4 л) и О,1 МЯаНСО, рН 8,6 (1 л). В результатереакции получают матрицу с 30 мкмолэпоксигрупп на 1 мл геля. Затем200 мг тироксина растворяют в 10 мл1 М ИаОН, перемешивают 4 ч при комнатной температуре и оставляют наночь при 2-8 С. По окончании реакции аффинный сорбент промывают 0,1 МВаНСОз .рН 8,6 (4 л). Полученный сорбент, содержащий 2,4 мкмол иммобилизованного тироксина 1 мл геля,разбавляют сефарозой 4 В до концентрации тироксина 1 мкмол на 1 мл геля. Концентрацию иммобилизованноготироксина определяют согласно 12.П р и м е р 2. Получение белка,связывающего тироксин,1 л сыворотки ретроплацентарнойкрови перемешивают в течение ночиопри температуре 4 С со 100 мл аффинного сорбента, содержащего 1 мкмолконъюгированного тиРоксина на 1 млгеля, что создает концентрацию тироксина во всем объеме суспензии1 10 мол. Аффинный сорбент отделяютпутем фирьтрования суспензии на по932817 3ромывают 1,5 л 9,0. Гель переносят стым стеклянным ают отмывку до с постоянной оптипри 280 нм.Злюцию осуществляют при туре 0,001 М НаОН, элюции 3 мл/мин. связывающего тироставляет 45 мг или 9 0 0 кти ви- ого продукта в за чества аффинн л сыворотки) 15 20 3 6 2 О.филиппова Техред. Л.Олейник,Редак ктор В.Бутя Тираж 343 Подписносударственного комитета СССР.м изобретений и открытийква, Ж, Раушская наб д. 4/5 каз 4/3ВНИИПИ Гпо дел3035, Мо изводственно-полиграфическое предприятие, гужгород, ул, Проектная,ристом фильтре и п0,1 М БаНСО, рНна колонку с порифильтром и продолжполучения элюатаческой плотностьюцелевого продуктакомнатной темпера, рН 11,0. СкоростьКоличество белка,ксин в элюате со90 Х.Выход целевогосимости от колисорбента (на Технико-экономическая .эффе вность изобретения состоит в повьппении выхода белка, связывающего тиро-ксин. Способ гарантирует одностадийное, практически количественное, выделение из сыворотки ретроплацентарной крови белка, связывающего тироксин, Воспроизводимость способапрактически количественный вюсод белка, связывающего тироксин, низкаястоимость и доступность сырья делаетвозможным наладить опытно-промышленный выпуск диагностических наборовдля определения тироксина, основнымкомпонентом которых является белок,связывающий тироксин,