Способ получения дипептидов или их приемлемых для пищевых продуктов солей

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛ ИСТИН ЕСКРЕСПУБЛИК 6817 01 К 5/06 А 23 3. 1/2 ЗОБ РЕТ СА Я ТЕН Изобрете учения дипеп пищевых про чески активнь найти примен ности. к способу пол-.иемлемых для овых биологи- которые могут й промышлейние относится тидов или их и дуктов солей -х соединений ение в пищев эф ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯРИ ГКНТ СССР(71) Дженерал Фудс Корпорейшн (ОЯ)(72) Паул Роберт Занно, Гленн Майкл Роуи Рональд Эдвард Барнетт (08)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИПЕПТИДОВИЛИ ИХ.ПРИЕМЛЕМЫХ ДЛЯ ПИЩЕВЫХПРОДУКТОВ СОЛЕЙ(57) Изобретение касается пептидов, в частности получения дипептидов общей ф-лыНО-С(0)-СН 2 - СН(й Н)-С(0)-МН-С(А)(СНз)- С(0)-Ор(+)фенхил, где А = Н или СНзсусловием, что, если С является асимметричнымили хиральным центром, то этот углерод буЦель изобретения - получение новых производных дипептидов - малотоксичных и обладающих более высоким подслащивающим эффектом,П р и м е р 1. (р(+)Фенхиловыйсложныйир, а-:аспартил-метилаланина.Аминоизомасляную кислоту, защищенную группой М - СВЕ, растворяют в 1,2-дихлорэтане (50 мл) в атмосфере аргона при 0 С. В 1,2-дихлорэтан (10 мл) добавляют раствор Й,й-диметиламинопиридидет иметь О-конфигурацию, или их приемлемых для пищевых продуктов солей, что может быть использовано для обеспечения подслащивающего эффекта, Цель изобретения - повышение сладости и снижение токсичности нового соединения указанного класса. Синтез ведут. реакцией производного кврбоновой кислоты ф-лы Е-ЙН-СН(С/О/ОВ)-СН 2-С(0)-ОН. где Е = Н, аминная защита, с амином ф-лы СНзС(А)(й Н)2-С(0)-Оф+)фенхил, в аминообразующих условиях с последующим удалением, в случае необходимости, защитных групп ивыделением целевого прбдукта в свободном виде или в виде их солей. Новые вещества имеют высокую стабильность в буферных растворах при рН 3 или 5, или 1, Я практически не токсичны и превосходят по сладости аспартам 5 - 23 раза и сахарозу в 900-5900 раэ. 2 табл,на (0,5 эквивалента) и 3(+)фенхилового спирта (1 эквивалент). Затем добавляют дициклогексилкарбодиимид (1,1 эквивалента) в твердом виде. После пяти дней перемешивания при комнатной температуре из раствора удаляют мочевину фильтрованием, а полученный фильтрат разбавляют петролейным эфиром (50 мл). Этот раствор затем снова осветляют фильтрованием, а полученный фильтрат выпаривают до образования пасть 1 в высоком вакууме в роторном испарителе, Колоночной хроматографией на силикагеле с использованием петролейного эфира и этилацетата при соотношении 15:1 получают чистый продукт с выходом в 15 - 19 О/о в виде белого кристаллического вещества, 1681732(с, 5 Н).а 2 о -= -11,65 (МеОН).Т. пл,83-85 С.Защитную группуудаляют гидрогенизацией в присутствии палладия на угле (107 ь)в метаноле с количественным выходом свободного аминоэфира,Амин тут же растворяют в М,й-диметилформамиде и связывают с предшественником аспаргиновой кислоты сиспользованием хлорида меди (И) с получением 90 о -ного выхода сложного,Вбензилового эфира - а 2-метилаланинЩ+)фенхилового)эфира Й-СВЕ а:аспаргиновой кислоты.ЯМР (СОСз); д 0,90(С, ЗН); 1,05(с, ЗН);1,10 (с, ЗН); 1,20 - 1,80 (м, 7 Н); 1,6 (д, 6 Н);2,70 - 3,15 (м, 2 Н); 4,1 - 4,2 (м, 1 Н); 4,20 (с, 1 Н);4,60 (с, 1 Н); 5,10 (с, 4 Н); 5,60 (д, 1 Н); 5,80 (д,1 Н); 5,90 (д, 1 Н); 7,40 (с, 10 Н).Защитную группу продукта удаляютгидрогенизацией с последующей очисткойколоночной хроматографией, Вр С 1 в, с использованием элюанта метанол - вода присоотношении 85;15,а)25 =-3,30(МеОН), Т, пл. 121-123 С.Определение сладости этих соединений дало следующие результаты (табл. 1),П р и м е р 2. а-.-Аспартил-О-аланинД+)фенхиловый 1 сложн ый эфир.А. Экзо-ф- (+) - фенхол,В кипящую суспензию, состоящую из72,65 г изопропилата алюминия в 300 млтолько что перегнанного изопропиловогоспирта, добавляют по каплям 27,1 г й+)фенхона в 50 мл изопропанола, Реакциюпрекращают через шесть дней, когда с помощью газовой хроматографии (Карбовакс20 М) определяют, что содержание кетонауменьшилось более чем на 50 о , С помощью капиллярной хроматографии (Супелковакс 10) также определяют, чтоотношение экзо/эндоизомеров для фенхола равно 3/1. После охлаждения эту смесьфильтруют и тщательно промывают дихлорметаном. Полученный осадок растворяютв 5 о -ной НС (100 мл) и экстрагируют дихлорметаном. Затем обьединенные растворы дихлорметана промывают 506 ной НС(50 мл), насыщенным раствором ИаНСОз(50 мл) и водой (50 мл) и высушивают надМ 9304, Фильтрованием и удалением растворителя получают 23,44 г масла, котороена 406 состоит из непрореагировавшегофенхона и на 606 из изомерова- иВ-фенхола,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В течение 24 ч кипятят смесь из 12 г (0,78 моль) В - и а -фенхола, 11,9 мл (1,1 эквивалента) триэтиламина и 15,9 г пара-нитробензоилхлорида (1,1 г) в 500 мл сухого дихлорметана. Затем разделяют смесь В /а сложных эфиров с помощью вытеснительной хроматографии на силикагеле с использованием гексан/этилацетат при их соотношении 40/1. Выделяют 6,0 г экэофенхил-пара-нитробензата, а) р = -17,1 О (в бензоле), После гидролиза в щелочной среде нитробензатного эфира (кипячение в избытке ИаОН в метаноле) получают 3 г фенхола (9/1 ф /а).,В - (+)-фенхол;а 2 о = =+23,4 (чистый).ЯМР: д 0,95-1,8 (16 Н, м, СН 2, СНз); 3.0 ч на млн. (1 Н, с, СН-О).8. М-СЬх-О-Аланин, Р -(+)-фенхиловый сложный эфир.В тщательно перемешанный раствор 1,3 г 3-(+)-фенхола в 20 мл сухого дихлорметана добавляют 1, 9 г (0,0084 моль) МСЬЕ-О-аланина и полученный раствор охлаждают до 0 С, Затем добавляют сюда 0,113 г пара-диметиламинопиридина и 1,91 г дициклогексилкарбодиимида. После 24 ч реакцию прекращают и раствор фильтруют, Растворитель испаряют, а масляный остаток растворяют в диэтиловом эфире, затем тщательно промывают 5-ной НС (25 мл), насыщенным йаНСОз (25 мл), водой (25 мл) и высушивают над М 9304. После фильтрации и испарения растворителя полученный продукт очищают хроматографией на силикагеле с конечным выходом 1,86 г й - СЬг - О-аланинф -(+)-фенхилового эфира.а о =+3,86ЯМР:д 0,8 - 1,8 ч. на млн, (19 Н, м, СН 2, СНз); 4,2 ч. на млн, (1 Н, с, СН - О); 4,4 ч. на млн, (1 Н, м, СН-:); 5,1 ч. на млн, (2 Н, с, СН 2-РЬ); 5,4 ч. на млн, (1 Н, д, ИН); 7,4 ч, на млн,(5 Н, с, РЬ).С. О-Аланин, В -фенхиловый сложный эфир.И-С Ьл-О-алан и н, В-(+)-фенхиловый сложный эфир растворяют в 50 мл метанола и гидрируют 2 ч над 0,1 г 5 Рб/С в трясучке Паара. Затем раствор фильтруют через целит, промывают метанолом, концентрируют и кристаллизованный остаток растворяют в дихлорметане.О, й-СЬл-ф-Бензил:аспартил-О-аланин, Р-(+) фенхиловый сложный эфир,В дихлорметановый раствор, содержащий сложный эфир О-аланина (0,00355 моль), добавляют эквимолярное количествоф-бензил й-СЬкаспаргиновой кислоты(1,27 г) и 0,526 г Сц (И) О 2. После растворения СоО 2Определение сладости этого соединения дало следующие результаты (табл, 2). 35 Полученные дипептиды получают или в виде свободной кислоты, или в виде в пищевом отношении приемлемых. солей,40 например в виде соответствующих аминосолей, т.е. в виде следующих соединений гидрохлорида, сульфата, гидросульфата, нитрата, гидробромида, гидройодида, фосфата или гидрофосфата; или в виде солей щелочного металла, например натрия,калия, лития, или же в виде таких солей щелочноземельных металлов, как кальций или магний, а также солей алюминия, цинка и других подобных солей.Превращение производных свободного пептида в их физиологически приемлемые соли осуществляется обычными хорошо известными способами, например непосредственным контактированием соединений формулыс минеральной кислотой, гидро- окисью щелочного металла, окисью щелочного металла или карбонатом, либо гидроокисью щелочноземепьного металла,50 55 добавляют ДЦК (0,81 г). После 24 ч реакциюзаканчивают, отфильтровывают мочевину ииспаряют растворитель, Желтое масло растворяют в диэтиловом эфире (25 мл и,промывают 5-ной НС (25 мл), затем 5насыщенным раствором МаНСОз (25 мл) иН 20 (25 мл), Слой простого эфира высушивают над МдЯ 04 и испаряют с получением0,95 г конечного продукта,ЯМР: д 0,85 - 1,80 (19 Н, м, СН 2, СНз); 104,2 ч. на мпн. (1 Н, с, СН-О);4,5-4,7 ч. на млн,(1 Н, д, МН); 7,4 ч. на мпн. (10 Н, с, РЬ),Е. а-:Аспартил-.О-аланин, ф-(+)-фенхиловый сложный эфир.0,95 г защищенного дипептида растворяют в 50 мл метанола, в который добавляют 0,1 г 10 Рб/С. Полученный растворгидрогенизируют в течение 24 ч в трясучке 20Паара. Полученный таким образом раствор фильтруют и испаряют досуха с получением 0,194 гтвердого вещества:(аф 0-0,867 С.Полученный продукт очищают на ВЭМХ 25с обращением фаз (85% метанол/вода) сполучением 75 мл :аспартил-О-аланина,о(+) фенхилового сложного эфира.ЯМР: 0,8 - 1,8 (19 Н, м, СН 2, СНз); 2,3 -2,4 ч. на млн. (2 Н, м, СНг-С);4,2 ч, намлн. 30(1 Н, с, ОСН); 4,5 ч. на млн, (2 Н, м, М-СН);8,8 ч. на млн. (1 Н, с, Н-С). его окисью, карбонатом, либо его прочими более сложчыми соединениями.Перечисленные выше и физиологически приемлемые соли можно также испольэовать в качестве подслащивающих агентов, которые обычно имеют повышенную растворимость и стабильность по сравнению со своими свободными формами.П р и м е р 3. Изучена стабильность а- -аспартил-метилаланин ф(+)фенхиповогосложного эфира (пример 1), а Л.-аспартил-О-аланин-ф+)фенхилового 1 спожного эфира (пример 2) и аспартам ( -аспартил- -Фенилапанинметилового эфира) в буферных растворах при рН 3, 5 и 7 при 50, 75 и 100 С, были получены следующие результаты:Период вращения, при100 С рН 3 рН 5 рН 7 Пример 1 8,4 33 67Пример 2 3,9 14 10Аспартам 5 3 5,3 1Период полупревращения, дни, при 75 С рН 3 рН 5Пример 1 3,0 15,0Пример 2 13 51Аспа ртам 0,9 1,1Период полупревращения, дни, при 50 С рНЗ рН 5Пример 1 64 150Пример 2 22 131Подслащивающие вещества по примерам 1 и 2 имеют исключительно высокую стабильность в буферных растворах при рН 3, 5 и 7. Соединения примеров 1 и 2 обладают лучшей стабильностью в буферных растворах по сравнению с аспартамом, за исключением случая с рН 3 при температуре 100 С, когда аспартам имел промежуточную стабильность между соединениями примеров 1 и 2. Соединение примера 1 болеестабильно, чем соединение примера 2. Период попупревращения соединения примера 1 бып в два- и три раза продолжительнее в буферных растворах при 75 и 100 С и рН 3 и 5, чем период полупревращения соединения примера 2, Период полупревращения соединения примера 1 в буферном растворе при 50 Си рН 5 был в 1,1-2,9 раза продолжительнее, чем у соединения примера 2.Проведенные испытания показали, что производные дипептидов, полученные в условиях предлагаемого способа. - соединения практически нетоксичные и слаще сахарозы в 900-5900 раз и превосходят по сладости аспартам в 5-23 раза.1681732 10 ентрация,мас,аблиц я,мас,фф формула изобретенияСпособ получения дипептидов общейформулы- СН - СОВЕСБСООНхх-"-в,) сн,МООР (+) (решил,где А - водород, метилс условием, что, если помеченный звездочками углерод является асимметричным илихиральным центром, тогда этот углерод будет иметь О-конфигурацию,или их приемлемых для пищевых продуктовсолей, о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтопроизводное карбоновой кислоты формулы 0,00750 0,00375 0,00185 0 006 с 2 0,0025 0,0025 0,0025 0,005 0,005 0,005 0,01 0,01 Е - ЗН - СН - СООНсн,соов5 где Е- Н или аминозащищающая группа;В - Н или карбоксилзащищающая группа,вводят во взаимодействие с амином формулыН Б- СА) СНеС 00 р (+ еренхолв аминообразующих условиях с последую 15 щим удалением в случае необходимости защитных групп и выделением целевогопродукта в свободном виде или в виде ихсолей,Таблица 1