Вектор pfh 124 для получения фрагментов днк с произвольными “липкими” концами и способ его конструирования

ОСУДАРСТВЕННЫПО ИЗОВРЕТЯНИЯМПРИ ГКНТ СССР. сследователой биологи(57) Изобрелярной биол та ДНК содерж 11 - ФрагмРж рЦС 18 ликок мазы, пицилл азмидыащего репр -лак тасть к амИзобретени рной биологи етно к получ тодами генет 18 и ге устойчи ну т наит гии при создани целевых продуктЦелью изобре ние стабиль т фТ 1 - фрагмент(320 п,о), став часть мо галактоэидазы кер, имеющий змиды6 гоанно Рчц МВ 12 ьой. с ена р вкл ения явля рекомбин ется повышнтов .уированиемсостоящей ицир и синт трукту тическийУ ТСССССТСАТССАСАСССССАСТАССТСТТАА,ССАТСССССТССАСААССТАССТТССАССТССТАСССССАССТСТТССАТССААС та по сод энд про твляетс для клониров аТ С 1 и Ваш области. Е ия осущ 1-сайта сть век олилинк ерра не менее 1 и Ня сайты С 1, Ассубфраг дпя ной 200 ен хпс(71) Всесоюзный научноский институт молекуляр(56) Авторское свидетельпо заявке У 4149175/28 кл. С 12 Ы 15/00, 30.09 ЕН 124 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯК С ПРОИЗВОЛЬНЫМИ "ЛИ И СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИ ение относится к молеку. - гии и генетической .инжеотносится к молекуи биотехнологии, коннию рекомбинантных ДНК ческой инженерии, и менение в биотехноло- и штаммов-продуцентов Цель достигается констторной плазмиды рРН 12следующих элементов: ржащий между попарными уклеаз рестрикции Ро 1 с ивоположной полярности нуклеаз рестрикции Ба 111 и Баш НТ. Вставка нерии. Целью изобретения является повышение стабильности, Сконструирована векторная ДНК рУН 124, имеющая молекулярную массу 1,8 Мд, содержащаяРчо 11 - большой Фрагмент ДНК плаэмиды рцС 18 с репликоном этой плазмидыи геном -лактомазы, а также Рчм Пмалый фрагмент ДНК плазмиды рМВ 124,включающий часть модифицированногогена -галактозидады с синтетическимполилинкером. Полилинкерная сбластьдлиной 42 и о. ограничена Е. соКТ иРзС Т сайтами, а между попарными сайтами Уо 1 с 1 и Няа 1 противопойожнойполярности содержится набор сайтовэндонуклеаэ рестрикции Яа 1 СТ, Асс Т,Ндпд 11, Ваш Н 1, 2 с.п, Ф-лы, таммьгхозяева: штаммь Е. со 11. с ас ЕУ 1 15-фенотипом. Молекулярная масса плаэпщы рГН 124 равна 1,8 Мс (2684 п,о.).Для достижения цели иСпользуют .пособ конструирования вектора РЕН 124, заключающийся в том, что ДНК рПС 18 гидролиэуют эндонуклеазой рест рикции Ртщ 11, вьцеляют Фрагмент дли О ой 2364 п,о., циклиэуют его с помою Т 4 Д 1 К-лигаэы, полученной лигазНой смесью, трансформируют Клеткисо 1 х ТМ 103, отбирают клоны, устойчивые к ампициллину с Ьас-феноти" Йом. ДНК, полученную из этих клонов, расщепляют эндонуклеазой рестрикции Рш 11 и лигируют с Рчп-фрагментом ДНК рМВ 124 (320 п, о, ), попученной лигаэной смесью, трансформируют клетки 20 Е. со 1 д ТМ 103, отбирают клоны, устойчивые к ампициллину с Ьас-фенотипом.Прим е р 1. 50 мкгДНКплаэмиды рМВ 124 гидролизуют эндонуклеа згй рестрикции Рю 1 Т в 100 мкл раствора, содержащего буфер 150 мМ трисНС 1, рН 7,5, 10 мМ МВС 1 О мМ 2-меркаптоэтанол) и 50 мМ ИаС 1 1 ч при 37 С. Реакционную смесь прогревают 30 2 мин при 65 С, добавляют 10 мкл 0,17. бромфенолового синего в 507-ном водном глицерине и подвергают электрофореэу в 47, ПЛЛГ. Фрагмент ДНК длиной 320 н.о. элюируют иэ геля на ионооб менную бумагу ДЕ. С бумаги фрагмент смывают 1,5 М ЫС 104 (рЯ 8,2 х 25 мкл)опри 50 С и осаждают 10 объемами ацвтона. Осадок промь,вают этанолом, высушивают на воздухе и растворяют.в 40 30 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-НС1 мМ ЭДТА, рН 8,0).мкг ДНК рЦС 18 гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Ртта 11 в услови" ях, описанных выше. 1 О мкл реакционной смеси после отжига (5 мин, 65 С) инкубируют,с 5 ед. ДНК-лигазы фага Т 4 в 20 мкл буфера 1, содержащего 0,25 мМ АТФ в течение 2 ч при 1 О"С. Десятую часть реакционной смеси используют,ппя трансформации клеток Е. со 1 ХМ 103, обработанных СаС 1 Плаэмида рБС 18 сообщает клеткам Е, со 1 ТМ 103 фенотип Ьас , Транс" форманты отбирают на 1,5% УТ-агаре, содержащем 50 мкг/мл ампициллина, У-да 1, 10 М ТРТС. Колснии, имеющие Ьас-фенотип, содержащие рцС 18 .без природного Рдд 11 фрагмента, культнвируют в 5 мп среды 12 ч при 37 С, 1 мкг плаэмидной ДНК, выделенной из этой биомассы расщепляют эндонуклеазой рестрикции Рчц 11 в объеме 30 мкл, Реакционную смесь разбавляют 10 объемами 27,-ной 1 ЛС 104 в ацетоне, осадок промывают этанолом, сушат на воздухе, Затем растворяют его в 30 мкл буфера 1, дополнительно содержащего 0,5 мМ АТФ и инкубируют с 1 мкг Рлз П-фрагмента ДНК (320 п.о) рМВ 124 в присутствии 5 ед. ДНК-лигаэы Фага Т 4 12 чопри 1 О С. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е, со 1 1 М 103, как описано вышеИз колоний, ииеющих .Ьас -фенотип, щелочным методом выделяют ДНК, которую анапиэируют путем Рщ 11, Вэр Т, Ваш Н 1. Ва 1 01-гидролиза.П р и м е р 2. Определение стабильности рекомбинантов вектора рРН 124 с максимальной и минимальной длиной встроенного фрагмента.а) для определения рекомбинантов вектора рГН 124 с максимальной длиной встроенного фрагмента в этом векторе клонируют по Рз 1 1 и Ба 1 1-сайтам фрагмент ДНК полноразмерной копии гена интерлейкина - 2 человека, длиной 413 п.о.Дпя этого 0,25 пкмоль векторной ДНК, полученной иэ рРН 124, совместным расщеплением эндонуклеазами рестрикции РзС 1 (7 ед. 50 мМ МаС 1,ч, 37 С) и Ба 1 С 1 (О ед. 150,мМ ЮаС 1 1 ч, 37 С) и 3 пкмоль указанного фраг-. мента ДНК обрабатывают 20 ед. Т ДНК- лигазы в условиях, описанных выше. Полученной лигаэной смесью трансформируют клетки Е. со 1 1 М 103, Колонию+с Ьас фенотипом проводят через 4. пассажа, как описано в примере 2. После каждого пассажа выделенную иэ биомассы рекомбинантную плаэмидную ДНК рП. 2 анализируют Рчи П, Ввр 1, Есо НТ -1 - Рзг. 1 эндонуклеаэами рестрикции. Результаты гидролиэа соот-, ветствуют ожидаемым и равны 200, 520, 2260 п.о. для Рчц 11 - рестриктаэы;11, 80, 202, 74, 267, 287, 290, 380, 434, 457 587 ш.о, для Вэр 1 - рестриктазы и 440 п,о, для Есо К 1 Рзг, Т пары рестриктаэ, Фенотип трансформированных клеток не зависит от числа проведенных пассажей. Количест-,. во колоний с указанными фенотипом . составляет 970+25 на 1000.шт при 957.уровня доверия;5 1552643 бб) для определения рекомбинантов зируют Ваш Н 1, Яа 1 С 1, Ввр 1 рестривектора рГН 124 с минимальной длиной ктаэами а также определяют нуклеовстроенного фрагмента в этом векторе тндную последовательность полилинкера клонируют два олигонуклеотида методом Максама-Гильберта, Клетки ССССТСАТССАС (12 п,о,) и5Е. со 11, трансформированные плаэмидой ААТТСТТССАТСАСССС (16 п,о.), которые рГН 125, имеют Ьас фенотип, который образуют между собой комплементарный не изменяется с числом проведенных дуплекс длиной 12 п.о. пассажей, На 1000 клонов с укаэаннымДля этого 5 пкмоль ДНК рГН 124 О фенотипом приходится 990+10 при 953 гидролиэуют 20 ед рестриктаэы Ва 1 С 1 уровня доверия, в 50 мкл буфера 1 и 150 мМ МаС 1 в условиях, описанных выше. Реакционную Таким образом, предложенный вектор смесь осаждают 23-ным ЬС 104 в ацето- рГН 124 пригоден для получения фрагне. Промытый и высушенный осадок ра ментов с произвольньие "липкими" кон" створяют в этом же объеме буфера 1. цами. Плазмиды рГН 123 и рГН 124 (ее К раствору добавляют дЯТР до концен- производная) имеют высокую стабильтрации 100 мкИ, 6 ед. ДИК-полимеразы ность. После 4 пассажей не менее 953 1 (фрагмент Кленова) и реакционную клонов сохраняют исходный фенотип. смесь выдерживают 10 мин при комнатной температуре. Затем смесь прогре- Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я вают 2 мин при 65 С, добавляют 5 мКаС 1, 20 ед. Есо К 1 рестриктазы и 1. Вектор рГН 124 для получения выдерживают раствор ещеч при 37 С фрагментов ДНК с произвольными "лип- ДНК из раствора осаждают 23-ным25 кими" концами с мол.мас. 1,8 Мй, .раэ" ИС 10 в ацетоне, Осадок растворяют мером 2684 п.о. и содержащий: в 100 мкл буфера 1. К раствору добав- Рчи 11 - фрагмент ДНК плаэмиды ляют по 100 пкмоль указанных вьпперПС 8 размером 2364 п,о. с репликоолигонуклеотидов, 20.ед. Т ДНК"лига- ном плаэмиды рУС 18 и геном Р-лактаэы и оставляют на 12 ч при 5 С. 30 мазы, определяющим устойчивость к ам 0 мкл лигазной смеси используют для пициллинутрансформации клеток Е.со 1 д 1 М 103. Рчи 11 - фрагмент ДНК плаз:щды Колонию с Ьас -фенотипом проводят+рИВ 124 размером 320 п,о ., включающий через 4 пассажа, После каждого пас- часть модифицированного гена -галаксажа выделенную из биомассы рекомби- тозидаэы и синтетический полилинкер35нантную плазмидную ДНК рГН 125 аиали- размером 42 п.о имеющий структуруССАТСССССТССАСААССТАССТТССАТСССССТСАТССАСАССТССТАСССССАССТСТТССАТССААССТАСССССАСТАССТСХТААа такжемежду попарными сайтами эндо-,нуклеаэ рестрикции ГО 1 и Няа 1 противоположной полярности-сайты дляэндонуклеаз рестрикции Яа 1 С 1, Асс 1,Нхпд 11 и Ваш Н 1;фрагменты размером 26, 34, 67; 110,147, 200, 242, 404, 432,. 489 500 п.о. . образующиеся после расщепления эндоиуклеазой рестрикции Мвр 1;фрагменты размером 11, 80, 100,164, 260, 267, 290, 434, 457, 587 п.о.,образующиеся после расщепления зндонуклеаэой рестрикции Вврфрагменты размером 8, 88, 181,244, 287, 616, 1244 п.о., Образу щи 55еся после расщепления эндонуклеаэойрестрикции Го 1;вставку .субфрагмента для клонирования по Ба 1 С 1 и .Ваш Н 1-сайтам полилинкерной области;емкость вектора от 12 до 413 п,о,; штаммы-хозяева: штаммы ЕвсЬег 1 сИа со 1 х с 1 ас Е ЬИ 5-фенотнпом; кратность клонируемого субфрагмента (Эп+2).2, Способ конструирования вектора- рГН 124, заключающийся в том, что ДНК рЮС 18 гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Рчи П, фрагмент ДНК размером 2364 п.о. цкклиэуют с помощью Т 4-ДНК-лигазы, полученной лигаэной смесью трансформируют клетки Есо 11 М 103, отбирают клоны, устойчивые к ампициллину с Ьас Е -фенотипом, далее ДНК, полученную иэ этих клонов, расщепляют эндонуклеаэой рестрикции Рчи 11 и лигируют с Рчц 11 - фрагментом ДНК- рМВ 124, полученной лигазной552643 Составитель Т, ЗабойкинаТехредИ,Дндык Корректор Л. Бескид Редактор Л. ЛалковаЗаказ 676 Тираж 373 ПодписноеВНФЙПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно"издательский комбинат "Патент", г.ужгород, уп Гагарина, 101 смесью трансформируют клетки Е. со 11И 103, отбирают клоны, устойчивйе к ампициллииу с Ьас - фенотипом И выделяют вектор рГН 124.