Способ выявления эндотоксинов грамотрицательных бактерий

Номер патента: 1142122

Авторы: Гремякова, Лиходед, Саенко

ZIP архив

Текст

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1) А 61 К 39 00 ИТЕТ СССР И ОТНРЫТЖ РЕТЕНИ кова едова- сыворо ство ССС,1983.ЭНДОТОККТЕРИИ Госуд АРственкыйПО ДЕЛАМ ИЗОБ ЕТЕН(21) 3493909/28-13 (22) 23.09.82 (46) 28.02.85. Бюл.Р 8 (72) В.Г.Лиходед, Т.А.Грем и А.С.Саенко (71) Московский научно-исс тельский институт вакцин и.(54)(57) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СИНОВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БА 801142122 А путем постановки реакции торможенияпассивной гемагглютинации исследуемой пробы с эритроцитами,сенсибилизированными гликолипидом из мутанта Яа 1 шопе 11 а ш 1 ппезойа К 595 о тл и ч а ю щ"и й с я .тем, что, сцелью повышенияспецифической чувствительности способа, исследуемыепробы предварительно обрабатывают0,10-0,25 М раствором гидроокисинатрия при 56-100 ОС в течение 10120 мнн с последующей нейтрализациейраствором соляной кислоты.Изобретение относится к медицине, а именно к способу выявления эндотоксинов (липополисахаридов) грамотрицательных бактерий с различной,антигениой специфичностью боковыхуглеводородных цепей. 5Известен способ выявления липидаА или гликолипида путем проведенияреакции торможения пассивной гемагглютинации с использованием эритроцитов, сенсибилизированных гликолипидом или липидом А (1.Основной недостаток этого способа состоит в том, что он позволяетвыявлять липид А или гликолипид лишьпосле их предварительного химического выделения из липополисахаридовили иэ бактериальных клеток. В отношении липополисахаридов, циркулирующих во внешней среде или в организме человека и животных, этот способхарактеризуется крайне низкой чувствительностью, так как нативные;:липополисахариды практически не тормозят реакцию пассивной гемагглютинации с гликолипидным или липиднымдиагностикумами,Целью изобретения является .повышение специфической чувствительности способа,Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу выявленияэндотоксинов грамотрицательных бактерий путем постановки реакции торможения пассивной гемагглютинацииисследуемой пробы с эритроцитами,сенсибилизированными гликолипидом из:мутанта Ба 1 аопе 11 а ш 1 ппеяоа К 595исследуемые пробы предварительнообрабатывают 0,10-0;25 М растворомгидроокиси натрия при 56-100 С в теочение 10-120 мин с последующей нейтралиэацией раствором соляной кислоты.Способ осуществляют следующимобразбм,Получение гликолипида. 30 г лисфильно высушенной биомассы мутантаЗа 1 шопе 11 а а 1 ппевоа К 595 экстрагируют трижды смесью хлороформ:метанолв соотношении 4:1, Объем смеси припервой экстракции составляет 450 мл,при последующих двух - по 200 мл.Объединенные экстракты доводят метанолом до конечного соотношения хлороформа и метанола, равного 1:2, иоставляют на 2 ч при 4 С,затем осадок, содержащий гликолипид, отделяют центрифугированием в течение20 мин при 6000 об/мин. Полученныйосадок переосаждают трижды при помощи той же процедуры, после чеговысушивают на воздухе. Выход сухого продукта - около 850 г. Препарат гликолипида хранят в высушенном виде при 4 С,Получение формалинизированныхэритроцитов. Свежие эритроциты от мывают 0,15-ным раствором хлористого натрия от плазмы и суспендируют в стандартном солевом растворе(ССР), содержащем 4,5 г цитрата,8,8 г хлористого натрия в 1 л дистиллированной воды, до 5-ной концентрации и диализуют против формалина(1/5 объема формалина от объема взвеси эритроцитов) в течение 5-6 .сутпри 4-6 оС, периодически помешивая,После диализа эритроииты отмываютССР, готовят 50-ную взвесь в ССР с1 формалина и хранят при 4 оС.Получение водорастворимого гликолипида. 10 мг гликолипида растворяют в 10 мл деионизированной воды придобавлении триэтиламина до конечнойконцентрации 1. Затем добавляют0,.5 мл раствора, содержащего бычийсывороточный альбумин в концентрации 2 мг/мл, перемешивают и отгоняют триэтиламин на роторном испарителе. Затем раствор, содержащий комплекс гликояипида с БСА, разводятв 5 раз 0,2 М фосфатным буфером рН6,4 до концентрации гликолипида200 мкг/Мл.Сенсибилизация эритроцитов. 5 мл50-ной суспензии формализированныхэритроцитов трижды отмывают ССР отформалина. 5 мг танина растворяютв 195 мл забуференнога физиологического раствора (ЗФР) рН 7,2 (100 мл0,15 М раствора хлористого натрия +100 мл 0,15 М натрия-фосфатного буфера), суспендируют в этом же раст-.воре формалинизированные эритроциты,инкубируют 10 мин при 37 С и отмывают дважды ЗФР путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 15 мин.К осадку добавляют 50 мл ЗФР ((рН 6,4), содержащего комплекс гликолипида с БСА в концентрации 200 мггликолипида в 1 мл. Смесь инкубируют30 мин при 37 С, отмывают триждыССР, содержащим 0,03 БСА (ССР-БСА)готовят 1-ную суспечзию эритроцитовв этом же растворе, добавляют формалин до конечной концентрации 1 ихранят при 4 С,Щелочный гидролиз эндотоксинов.2 мг ЛПС растворяют в 0,75 мл дистиллированной воды, содержащей 0,05 Мэтилен-диаминтетрауксусной кислоты(ЭДТА), и добавляют 0,25 мл 1 МИаОН. Смесь выдерживают при 56 оС 1 ч,Концентрация щелочи варьирует в пределах 0,1-0,25 М, температура -56 - 100 С, а время обработки в .10120 мин. После гидролиза растворнейтрализовали 10 М НСХ.Постановка реакции пассивнойгемагглютинации (РПГА). Для РПГА использовали 1-ную взвесь сенсибилизированных эритроцитов в ССР-БСА. Сыворотки перед исследованием прогревали 30 мин при 56 С. В качестве растворителя применяли 0,1 М мединалвероналовый буфер (МВБ) рН 8, б. Реакцию ставили в полистироловых пластинах. В каждую лунку вносили по 50 мкл растворителя. В первую лунку затем вносили 50 мкл сыворотки к гликолипнду и готовили двукратные разве дения. Затем в каждую лунку добавляли по 25 мкл взвеси эритроцитов,Пластины выдерживали 1 ч при комнатной температуре и затем определяли последнее разведение сыворотки, в котором 10 наблюдается гемагглютинация.Постановка реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). В каждую лунку вносят по 25 мкл растворителя для РПГА. Затем в первую 15 лунку вносят 25 мкл раствора гликолипида в концентрации 100 мкг/мл или исследуемого раствора до и после обработки щелочью и готовят двукратные разведения. После этого в каждую 20 лунку добавляют по 25 мкл сыворотки к гликолипиду, разведенной в 2-4 раза меньше ее титра, и по 25 мкл 1-. ной суспензии сенсибилизированных эритроцитов. Пластины выдерживают 1 ч при комнатной температуре и затем определяют минимальную концентрацию гликолипида, тормозящую РПГА, а также минимальную концентрацию исследуемого эндотоксина, вызывающую РТПГА.Предложенный способ по сравнению с известным обеспечивает повышение. специфической чувствительности.П р и м е р 1. Ингибирование РПГА различными ЛПС.Результаты торможения РПГА различ-З 5 ными ЛПС. до и после их обработки щелочью (0,25 М МаОН, 56 С, 1 чпред-. ставлены в таблице.Как видно из таблицы, различные ЛПС тормозили РПГА с гликолипидным 40 диагностикумом в концентрациях,превышающих 2000 мкг/мл (дополнительные эксперименты показали,что для . торможения необходима концентрация .нативного ЛПС не менее 10 мкг/мл). 45ЧОднако после щелочного гидролиэа ингибирующая активность ЛПС резко возрастала - минимальные ингибирую- щие концентрации колебались для различных препаратов ЛПС от 4 до 50 мкг/мл.После обработки щелоч ью ЛПС сохраняли способность тормозить РПГА с 0-антигенными эритроцитными диагностикумами, т.е. сохраняли свою 0-специфичность (испытаны шигеллезные и сальмонеллезные диагностикумы и Экспериментальные эшерихиоэные диагностикумы, перекрестных реакций с нативными и гидролизованными ЛПС при этом не наблюдали). Таким образом, обработка щелочью приводит к раскрытию антигенных детерминант, распознаваемых антителами к гликолипиду.В РПГА с гликолнпидным диагностикумом были испытаны также препараты ЛПС, вьщеленные из различных штаммов сальмонелл, шигелл и кишечной палочки методом экстрации хлороформом и метанолом. Приведенные эксперименты показали, что эти препараты также приобретали способность тормозить РПГА с гликолипидным диагностикумом лишь после щелочного гидролиэа. В экспериментах были испытанытакже эритроцитарные сальмонеллезные"и шигеллезные диагностикумы экспериментальные эшерихиозные О-диагно- .стикумы и сальмонеллезные, шигел-,лезные и эшерихиозные диагностикумы,сенсибилизированные препаратами ЛПС,полученными методом хлороформ-метанольной экстракции. В РТП 1 А с этимидиагностикумамн были испытаны сенсйтины, использованные для получениядиагностикумов. В этих экспериментах РПГА тормозили только гомологичные сенситины независимо от их обработки щелочью,Таким образом, способность внявлять в РТПГА лнпополисахариды различных бактерий после их щелочного гидролиза обладает только гликолипыдныйэритроцитарный диагностнкуй.1142122 Исследованные ЛПС Минимальные ингибирующие дозы,мкгмл Послегидролиза До гидро- Прогрев лиза без ще- лочи 0,1 0,1 Гликолипид Шигеллы Зонне1 Фазы 50)2000 2000 )2000 15 Шигеллы Зонне2 фазы Эшерихия коли 0127 )2000 15 Сальмонеллы тифимуриум 30 2000 15)2000 Сальмонеллы тифа Составитель В.Дроздов Редактор Н.Швыдкая Техред М.Пароцай Корректор Е.СирохманЗаказ 591/6 Тираж 722 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений;и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 филиал ППП Патентф, г.ужгород, ул.Проектная, 4 Эшерихия коли ОШ Эшерихия коли 055 Эшерихия коли 01 Эшерихия коли 02 Эшерихия коли 020

Смотреть

Заявка

3493909, 23.09.1982

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК ИМ. МЕЧНИКОВА

ЛИХОДЕД ВЛАДИМИР ГАВРИЛОВИЧ, ГРЕМЯКОВА ТАТЬЯНА АНДРЕЕВНА, САЕНКО АЛЕКСАНДР СЕМЕНОВИЧ

МПК / Метки

МПК: A61K 39/00

Метки: бактерий, выявления, грамотрицательных, эндотоксинов

Опубликовано: 28.02.1985

Код ссылки

<a href="https://patents.su/4-1142122-sposob-vyyavleniya-ehndotoksinov-gramotricatelnykh-bakterijj.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ выявления эндотоксинов грамотрицательных бактерий</a>

Похожие патенты