Штамм -3 -продуцент эндонуклеазы рестрикции

СОЮЗ СОВЕТСКИХСаиикьеиРЕСПУБЛИК 5/00; С 12 ЕТЕНИ 54) -ЗЭ ВКМСТРИК.И.Ли,В.И.Таняшин,В.А.Ежов К-ЗР низм эндо зиологии гдсдоп апсТЬедг Кесое 978, чо 1. 4,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ ИСАНИЕ И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт биохимии имикроорганизмов АН СССР(56) 1. КоЬегсв К.З. КевМосЫдсасдоп Епгушев апйпдйдоп Бдсев. - "Сепе",р. 183-193. ККАТ 1 А МАКСЕЯСЕИЯНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕгайда шагсевсепв ВКМая коллекция микрооргМ АН СССР) - продуценестрикции Бша 1,ШТАММ БЕПРОДУЦЕ МА 1.Штамм Бе (Всесоюз в при ИБ уклеазыИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано дл. получения эндонуклеазы рестрикции Бща 1 (К.Бща 1).К,Бща- эндонуклеаза рестрикции, разрезающая двунитевую молекулу ДНК в участках, имеющих нуклеотидную последовательность К,Бща 1 5ССС ССС 3 3ССС ССС 5 1 О В результате образуются фрагменты с "тупыми" концами. К.Бща 1 используется в работе в области молекулярной биологии, генетики, генной инженерии.Известен единственный штамм - продуцент К.Бща 1 - Беггаг 1 а щагсеясепяБИзвестный штамм - продуцент рестриктазы Бща. 1 Беггаг 1 атпагсевсепв Бвустойчив ко многим антибиотикам (Бц,Кщ, Тс, Стп, Рп, Рг, Ох, Бтп), но чувствительный к ампициллину.Нами был взят вариант продуцентаБеггаг 1 а щагсевсепя БВК, который устойчив к ампициллину. Подобной множественной устойчивостью к антибио ЗОтикам обладают многие штаммы Беггаг 1 ащагсеясепя, не являющиеся продуцентами рестриктазы Бща 1. Для подготовкиштамма-продуцента К.Бща 1 к ферментации в условиях производства целесо -образно ввести специфический генетический маркер.Цель изобретения - обесечение возможности отбора и контроля при культивировании штамма, что особенно важ.но в условиях промышленного получения фермента К.Бща 1.Поставленная цель достигаетсятем, что в качестве штамма-продуцента К.Бща 1 используют штамм Беггаг 1 ащагсевсепв БВКТр. Он депонирован во 45Всесоюзной коллекции микроорганизмовпри ИБФМ АН СССР под номером ВКМК-ЗД,Штамм обладает селективным маркером, обеспечивающим устойчивость к 5 Отриметонриму (Тр), который он стабиль.но сохраняет.Описание штамма-продуцента К.Бща 1Беггаг 1 а щагсеясепв ВКМ К-ЗД.Морфологические признаки, Грамотрнцательная подвижная палочка с перитрихальными жгутиками. Принадлежит ксемейству ЕпгегоЬасгег 1 асеае. Образование недиффундирующего пигмента продигиозина варьирует в зависимости отусловий культивирования и среды.Физиолого-биохимические признаки.В качестве источника углерода могутбыть использованы цитрат и ацетат.Из углеводов сбраживает целлобиозу, инозитол, глицерол без выделениягаза и мальтозу, сахарозу, глюкозус выделением небольшого количествагаза. Не сбраживает арабинозу,Реакция с метилротом - отрицательная, а реакция Фогеса-Проскауераположительная,Содержание Г+Ц в ДНК 58-58,4 мол.7.Образует эндонуклеазу рестрикцииДНК Бща 1 и неспецифические ДНКазы,В зависимости от условий культивирования уровень активности ферментаБща варьирует от 200 до 800 ед на1 г биомассы.Культуральные признаки. Хорошорастет на твердых и жидких мясопептонных и минеральных средах. Оптимальная температура роста 30 С.Генетические признаки. Содержитрекомбинантную плазмидную ДНК мол,веса 5,4 тысяч п.о., обеспечивающую устойчивость штамма к триметоприму (1,5-500 мкг/мл).Чувствителен к налидиксовой кислоте, канамицину, гентамицину и неомицину.Штамм получен . трансформациейштамма Б. щагсевсепв БВК плазмиднойДНК рВК 322 Ггд. Было показано, чтоштамм Б.щагсеясепя БВК чувствителенк присутствию в минимальной питательной среде 1-2 мкг/мл триптометоприма,химического вещества антибактериального и противоопухолевого действия.В основе механизма устойчивости ктриметоприму лежит его взаимодействиес ферментом дигидрофолатредуктазой,катализирующей восстановление дигидрофолиевой кислоты в тетрагидрофолиевую, Последняя участвует в биосинтезепуринов и пиримидинов. Как аналог фолиевой кислоты, триметоприм являетсяконкурентным ингибитором фермента.Этим объясняется чувствительностьбактериальных штаммов к триметоприму(ЕвсЬег 1 сЬ 1 а со 11, Бггар 1 ту 1 ососсцяацгецв, Ргогецв щ 1 даг 1 в),При исследовании некоторых мутантов Еясйег 1 сЫа со 11, устойчивых к Тр, показано два типа устойчивости, В одном случае устойчивость объясняз 11147ется повьппенным синтезом дигидрофолатредуктаэы мутантом по сравнению сдиким штаммом, в другом случае - несколько измененными свойствами дигидрофолатредуктазы у мутанта. 5В результате клонирования структурного гена, кодирующего дигидрофолатредуктазу фага Т 4 в плаэмидныйвектор рИК 322, получена рекомбинантная плазмидная ДНК рВК 322 Ггд. В 1 Оплазмиду рВК 322 интегрирован Нпд 111фрагмент фага Т 4 размером 1, 1 тыс.пар оснований, содержащий структурныйген дигидрофолатредуктазы. Введениеплазмидной ДНК рВК 322 Ггд в бактери альные клетки придает им устойчивостьк триметоприму. Цель достигнута тем,что вводится новый специфический маркер в микроорганизм с множественнойустойчивостью к традиционным лекарст- щовенным веществам. Это позволяет привыращивании Б. щагсеясепя БВКТр использовать селективные среды, содержащие Тр. Генетический маркер в составе плазмидной ДНК стабилен - при 25выращивании в неселективных условияхлишь около 6 клеток Б.щагсеясепв,БВКТр за 50 генераций теряют устойчивость к триметоприму. Это дает возможность следить за штаммом при егохранении, пересевах и больших ферментациях в промышленном масштабе.П р и м е р. Получение штаммаБеггага щагсеясепв ВКМ К-ЗД.Трансформация Беггаг 1 а щагсеясепя35БВК. Кальциевые клетки Яеггага щагсеясепя ЯВК трансформируют ДНК рекомбинантной плазмиды рВК 322 Ггд,несущей ген дигидрофолат-редуктазыфага Т 4 и обеспечивающей устойчивость 4 Ореципиентных клеток к триметоприму.Трансформированные клетки Беггагащагсевсепя высевают на поверхностиагариэованной среды, содержащей,г/л: ИНС 1 1; Ба 2 НРО 6; КНРО 3;ИаС 1 5; МяС 1 7 НО 0,1; СаС 1 2 НО0,015; глюкоза 2,бакто-агар 15, сдобавкой триметоприма 10 мкг/мл.Доказательство наличия плазмидной ДНК, обуславливающей устойчивость к 50 триметоприму клеток Беггага щагсевсепв. Методом скрининга выделяют плазмидную ДНК из всех полученных клонов Беггага щагсеясепя ВКМ К-ЗД, растущих на агаризованной среде с 55 10 мкг/мп триметоприма. Выделенной ДНК одного из этих клонов трансформируют клетки Евспеггсп 1 а со 11 802 с 00последующим высевом на селективную среду, содержащую Тр.Рестрикционный анализ полученной плаэмидной ДНК с помощью рестриктаэы Н 1 пд 111 указывает на наличие в ней фрагмента размером 1,1 тыс, пар оснований, обеспечивающего Тр-устойчивость бактериальных клеток.Проверка стабильности плазмидной ДНК в клетках Беггага щагсеясепя ВКМ К-ЗД. После 50 генераций в неселективных условиях (без добавки триметоприма) не более бклеток штамма-лродуцента Беггагда щагсеясепв ВКМ К-ЗД теряют плазмидную ДНК.Из этих данных следует, что клетки Беггагда щагсеясепя ВКМ К-ЗД стабильно сохраняют плаэмидную ДНК, обеспечивающую их устойчивость к триметоприму.Культивирование Беггага щагсевсепв ВКМ К-ЗД.Получение посевного материала.Хра-. нящуюся исходную культуру Беггаг 1 а щагсеясепя ВКМ К-ЗД рассевают на чашки Петри с агариэованной средой М, содержащей 10 мкг/мл триметоприма, и выращивают при 30 цС в течение 12 ч. Полученную на чашках культуру засевают петлей в пробирки с 10 мл среды М, содержащей 1 мкг/мп триметоприма, и выращивают при 30 С на качалке в течение 8 ч.Культуру из пробирок переносят в количестве 1% в колбы с 0,5 л среды Мс 1 мкг/мл Тр и выращивают при 30 С на качалке 12 ч (о.п. 0,9, кювета 0,3 см, ФЭК).Посевной материал в колбах используется для засева ферментера,Культивирование Беггага щагсевсепя ВКМ К-ЗД в ферментере. Количество посевного материала - Зот объема загруженной среды.Культивирование в ферментере ведут при 30 С, подаче воздуха 1,2 объема на 1 объем среды в минуту (90 л/мин), перемешивании 500 об/мин и до оптической плотности суспенэии клеток 1,25 ед (кювета 0,3 см, ФЭК).Продолжительность культивирования 5 ч на среде следующего состава,г/л: бакто-пептон 5, дрожжевой экстракт 5, КНРО 1, глюкоза 2.Выделение К. Бща. 1.Фермент выделяют стандартным методом. Выход фермента иэ клеток Беггага щагсеясепя ВКМ К-ЗД 400 ед на 1 г биомассы.Заказ 6735/18 Тираж 521 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул,Проектная, 4 Рассмотренный пример подчеркивает основное преимущество предлагаемого штамма-продуцента К.Бша перед исходным штаммом БВК (базовый объект).Оно заключается в том, что штамм содержит 5 маркерный ген дигидрофолатредуктазы фага Т 4, обуславливающий устойчивостьклеток Б. вагсезсепз к триметоприму,Таким образом, при использовании штамма в качестве продуцента К.Бва в промышленном производстве значительноупрощается его отбор и селекция.