Способ выделения лейцинаминопептидазы

СОЕЕТСНИХсаэамдьеии РЕСПУБ ГОСУД АРСПО ДЕЛ ПИСАН И БРЕТЕНИ ТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) 1-й Московский ордена Ленинаи ордена Трудового Красного Знаменимедицинский институт им.И.М.Сеченова(54)(57) СПОСОБ ВЦЦЕЛЕНИЯ ЛЕЙЦИНАМИНОПЕПТИДАЗЫ из биологических жидкос 0 1114 99 20 9/48; А 61 К 37/ тей, предусматривающий нанесение пробы жидкости на хроматографическуюколонку, заполненную сорбентом, с последующим элюированием целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью упрощения способа, в качестве исходного сырья используютбиологические жидкости больных с демиелинизирующими заболеваниями, вкачестве сорбента используют сефадекс3-75, промывают колонку физиологичес"ким раствором и выдерживают сорбированный на сефадексе фермент 3-4 сут,а целевой продукт элюируют физиологическим раствором.1 11146Изобретение относится к биохимии и предназначено для получения широко используемого в биологии и медицине фермента лейцинаминопептидазы.Известен способ получения лейцинаминопептидазы путем микробиологического синтеза с последующей многостадийной очисткой 11.Однако данный способ достаточно сложен, требует длительного времени 10 и дорогостоящих реактивов.Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ выделения лойцинаминопептидазы из крови убойных животных, заключающийся в нанесении исходной биологической жидкости на хроматографическую колонку, заполненную диэтиламиноэтилцеллюлозой, с последующим элюированием це-, щ левого продукта буферным раствором и диализом элюата после чего диализат подвергают повторной хроматографии на колонках с гидроксилапатитом и ДЗАЭ-сефадексом. Степень очистки 25 целевого продукта 5042 раза от исходного 23.Недостатками известного способа являются его сложность и многостадийность. 30Цель изобретения - упрощение способа.Указанная цель достигается тем,что согласно способу выделения лейцинаминопептидазы;из биологических35жидкостей, предусматривающему нанесение пробы жидкости на хроматографическую колонку, заполненную сорбентом, с последующим элюированием целевого продукта, в качестве исходного 40сырья используют биологические жидкости больных с демиелинизирующимизаболеваниями, в качестве сорбентаиспользуют сефадекс ч -75, промываютколонку физиологическим раствором 45и выдерживают сорбированный на сефадексе фермент 3-4 сут, а целевой продукт элюируют физиологическим раствором,Способ заключается в проведении 50 всего одной хроматографической стадии и обусловливает достаточно высокую степень очистки, в среднем 5161 раз. Упрощение способа при сохранении наибольшего эффекта очистки получают при 55 использовании сефадекса Я.При применении частиц декстрана с другими размерами пор (6-10, Ь -25,99 2Ф) степень очистки ниже, Жесткиеусловия опыта не позволяют использовать крупнопористые сефадексы.Оптимальное время инкубации сефадекса с адсорбированным ферментом установлено опытным путем и составляет 3-4 сут, При инкубации сорбированного фермента менее трех суток активность его не определяется или значитепьно снижена, а более четырех суток - активность фермента также низка по отношению к оптимальной, которая достигается при инкубации в течение 3-4 сут.Упрощенное получение фермента объясняется следующими причинами. В биологических жидкостях у больных с демиелинизирующими заболеваниями основная масса фермента лейцинаминопептидазы связана с ингибитором. Ингибитор имеет повышенное сродство к соединениям типа дектрана и мол. вес в пределах 20000-50000, поэтому он адсорбируется на колонке с размером частиц, соответствующим сефадексу Я, тогда как связанный фермент имеет мол. вес 150000 и в поры сефадекса ч -75 не проникает. Инкубация в течение указанного времени приводит к отделению фермента от ингибитора, после чего фермент элюируют физиологическим раствором. Ингибитор остается на колонке и может быть использован для реохроматографии.Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.Биологическую жидкость ,сыворотка, кровь, ликвор, моча) наносят на хроматографическую колонку с приспособлениями для центрифугирования, заполненную предварительно отцентрифугированным сефадексом-75, центрифугируют в течение 2 мин со скоростью 3000 об/мин, промывают физиологическим раствором для удаления балластных белков и вновь центрифугируют 2 мин со скоростью 3000 об/мин, Колонку инкубируют в течение 3-4 сут при 0-4 фС, а конечный продукт элюируют физиологическим раствором. П р и м е р 1, Сыворотку крови больного с рассеянным склерозом наслаивают на хроматографическую колонку (с приспособлениями для центрифугирования), заполненную предварительно отцентрифугиоояднным сефадексом Ь, центрифугируют 3 мин со скоростью 3000 об/мин промывают11146 чис з ороткави,оноры 0,0 20 мл физиологического раствора дляудаления балластных белков и вновьцентрифугируют 2 мин со скоростью3000 об/мин. Колонку, содержащую сорбированньсй фермент, инкубируют в течение 72 ч при 4,0 фС, конечный продукт элюируют 5 мл физиологическогораствора.Удельная активность ЛАП до инкубации 0,048 ед/г белка, после инкуба-Оции - 250 ед/г белка. Степень очистки 5208 раз,П р и м е р 2. Метод осуществляют аналогично примеру 1, при этом инкубацию проводят 96 ч. Удельная активность фермента до инкубации0,011 ед/г белка, после инкубации60 ед/г белка. Степень очистки5454 раза,П р и м е р 3. У больного с рассеянным склерозом берут ликвор, проводят исследования аналогичные примеру 1, инкубацию проводят 84 ч. Приэтом удельная активность ЛАП до инкубации 0,7 ед/г белка, после инкубации 3910 ед/г белка. Степень очистки 5585 раз.П р и м е р 4. Исследовали мочубольного рассеянным склерозом. Приемы исследования аналогичны примеру 1, з 0инкубировали 74 ч. Исходная активность ЛАП нулевая, после инкубации125 ед/г белка.Специфическая активность целевого продукта подвергается исследованию его активности с помощью ЛАП-теста фирмы Регшояпоз 1.Метод определения ЛАП основан натом, что лейцингидразид под влияниемЛАП расщепляется, отщепленный гидразин образует с 4-диметиламинобензаль 99 4дегидом в солянокислой среде оранжево-красное красящее вещество, которое определяют колориметрически. Испытания проводят в четырех пробирках. Вначале в пробирки 1 и 2 наливают по 0,5 мл лейцингидразида, выдерживают на водяной бане при 37 С в течение 1 О мин, в опытную пробирку добавляют 0,2 мп испытуемой жидкости. Далее все пробирки инкубируют на водяной бане при 37 С 30 мин, после инкубации, в контрольную пробу (пробирка 3) вносят 0,7 мл гидразина, а в пробирку (4 вносят 0,7 мл дистиллированной воды. Затем во все пробирки 1-4 добавляют по 5 мл диметилбензальдегида и быстро перемешивают содержимое пробирок.Далее в пробирку 2 добавляют 0,2 мл испытуемой жидкости и 30 мин инкубируют при 37 С. Не более, чем через 6 ч, изменяют экстинкцию опытной про" бы (пробирка 1) против пустой пробы (пробирка 2) и экстсснкцию контрольной пробы (пробирка 3) против второй пустой пробы (пробирка 4), длина волны 455 мм (можно в области 450-460 нм), ширина слоя 1,00 см. При расчете первое получессссое значение экстинкции делят не второс, активность фермента вьсраждют в единицах (1 ед. - количество ЛАП, которое расщепляет 1 мМоль е;лейцингссдразиде в течение 1 мин в условиях одной пробы).Одновременно в исследуемых образцах проводят количественное определение белка методом Лоури и удельную активность фермента выражают на 1 г белка. Выделение лейцинаминопептидазы из различных биологических жидкостей приведено в таблице.г1114699 34 О,1 0,06 7)1 510 О,1 Миопатия О, 13 0 Цирроз печени 0,45 Миопатия О, 15Миопатия О, 1 Радикулоневрит 0,2 0)036 0,12 0,046 Спинальнаяамистрафия 0,09 0,021 0 Рассеянныйсклероз О, 1 0,016 0,011 4875 0,05 60 5454 Миелит острый 0,25 0,048 250 5208 Ликвор,5 ил Мо зжечк овый синдром 0,006 1,5 Дискогенный радикулит 0,004 1,0 0,05 25 0,0036 Расс ея нныйсклероз О, 004 0,8 3750 4687 5585 3910 0,04 0,7 Моча 0 125 Цирроз печени Рассеянный склерозЗаказ 6735/18 Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4 Данные таблицы показывают, чтопредлагаемый способ эффективен прииспользовании биологических жидкостейтолько от больных демиелиниэирующимизаболеваниями. 5 предлагаемый способ значительно упрощен при сохранении высокой степени очистки, позволяет практически использовать биологический материал,взятый у больных с демиелииизирующими заболеваниями, который в настоящее время является отходом после клинико диагностических исследований.Преимуществом способа является возможность дальнейшего использования биологических жидкостей после сорбции лейцинаминопептидазы как исходного сырья для получения биологических препаратов.1