Штамм гриба fusаriuм охysроruм (sснlеснт)snydет hans для определения устойчивости сои к фузариозу

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК Об А(5)5 С 12 Й 1/14, А 01 К 63/ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ ЕЛЬСТ К АВТОРСКОМУ С инокулюма для искус сои, используемого и тойчивость к фузари ния является получ обладающего более зариевой кислоты и б тностью по отнош выделен из природ Гцзагав охузрогцв, оз всходов, поражен сои. Штамм гриба (зсЫеспт) спуд ет Нап в коллекции ВНИИС фузариевой кислоты Чапека составляет 84 ного - 40,8 мкг/мл, корня сои сорта Бук к - 8409 - 9,0 мм. 4 таб и АН не,С.,Корецкая тогенная м источники ГОЯАВОМ УО ЕТ НАЙЯ ЙЧИВОСТИ ельскому хоновый штамм я получения верно превышал остальные штаммы природных изолятов по патогенным свойствам.Штамм идентифицирован по определителю В,И,Билай. Депонирован в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии под М 35.Штамм гриба Гцзапцв охузрогцв (ЯсЫехт)Япу(1 ет Напз 690-10 имеет следующие культурально-морфологические и физиологобиохимические признаки: спорообразующий, макроконидии образуются в воздушном мицелии, веретиновидно серповидные, зллиптически изогнутые или почти прямые с постепенно и равномерно сужающейся неудлиненной верхней клеткой, с ясно выраженной ножкой или сосочком, с 3 - 5 перегородками, Длинай - 37,4+0,29 мкм, одноклеточзобретение относит ву и представляет с Ецзагца охузрогц люма для искусств спольэуемого при с вость к фузариозу. ся к сельскому хобой новый штамм а для получения нного заражения елекции ее на усзяйст гриба иноку сои, тойчи макрокониди ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(54) ШТАММ ГРИБАОХУЯРОВОМ (ЯСН ЕСНТ) ЯйДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОСОИ К ФУЗАРИОЗУ(57) Изобретение относится кзяйству и представляет собойгриба Рцзэгца охузрогцв д Цель изобретен штамма, обладающе теэом фузариевой к вирулентностью поШтамм получен грибов Ецзагаа ох фузэриоз всходов, и дание сои. Путем и ния изолированных линии ки восп рия по модифициров изолят Р,охузрогцв ия - получение нового го более высоким синислоты и более высокой отношению к сое.из природных изолятов узрогцв, вызывающих оражение стебля и увяскусственного заражекорней сои устойчивой риимчивого сорта Букуан ному методу отобран 690 - 10. который достоственного заражения ри селекции ее на усоэу. Целью изобретеение нового штамма, высоким синтезом фуолее высокой вируленению к сое, Штамм ных иэометов грибов вызывающих фузариие стебля и увядание Ецзапцв охузрогцв з 690 - 10 депонирован ХМ под М 35. Синтез на 14 сутки на среде 9 мкг/мл, а у природвыэывает поражение урия - 34 мм, сорта1661206 40 50 ных микроконидий - 9,0+ 0,04 мкм. Хламидоспоры обильные промежуточные и верхушечные, шероховатые, неокрашенные. Образует круглые колонии с ровными краями с диаметром на пятый день при 24 о С 76,03.ф.0,61 мм, при 37 - 38 С 28,16.ф.0,32 мм, при 7 - 8 С 14,24-0,34 мм. Мицелий воздушно-пушистый, фиолетово-лиловый.8 ыращивание штамма осуществляют на указанных средах при 22-25 С,Морфолого-культуральные признаки культур описывают на седьмой день, характер спороношения - на 15-й день,При выращивании штамма на сусло-агаре колонии размером 7,07,5 см, круглые, невысокие, с ровными краями, нежно-пушистые, с возрастом уплотняющиеся и несколько сморщивающиеся, поверхность светло-фиолетово-лиловая. обратная сторона темно-лиловая, спорообраэующий, макроконидии образуются в воздушном мицелии, веретеновидно-серповидные, эллиптически изогнутые или почти прямые с постепено и равномерно сужающейся неудлиненной верхней клеткой, с ясно выраженной ножкой или сосочком, с 3 - 5 перегородками, Длина макроконидий 37,4+0,29 мкм, одноклеточных микроконидий 9,0+0,04 мкм. Хламидоспоры обильные промежуточные и верхушечные, шероховатые, неокрашенные,На картофельно-декстрозном агаре колонии размером 6,0 - 6,5 см, круглые, невысокие, ровные, пушистые, с возрастом уплотняющиеся, бело-лиловые, обратная сторона темно-лиловая. Спорообразующий, макроконидии образуются в воздушном ми-целии, веретеновидносерповидные, зллип 5 10 15 20 25 30 35 тически изогнутые или почти прямые, с постоянно и равномерно сужающейся, не- удлиненной верхней клеткой. с ясно выраженной ножкой или сосочками, с 3 - 5 перегородками, Длина макроконидий 35,5+0,23 мкм, одноклеточных микрокони дий 8,7+0,02 мкм, Хламидоспоры обильные, промежуточные и верхушечные, шероховатые, неокрашенные.На агаризованной среде Чапека колонии размером 5,0-6,5 см, круглые, невысокие, ровные, пушистые, с возрастом уплотняющиеся, белые, обратная сторона белая или желтоватая.Спорообразующий, макроконидии отсутствуют, микроконидии обильные, эллипсоидальные, овальные и шаровидные, одно-, реже двухклеточные размером 5,0 - 9,0 х 3,5 - 5,0 мкм, Хламидоспоры обильные, промежуточные и верхушечные, шероховатые, неокрашенные.Отношение к источникам углерода; усваивает сахарозу, глюкозу; отношение к источнику азота: усваивает КИОз, ИаМОэ, казеин, соевый белок,Температура роста; минимальная о4 - 6 С; максимальная 37,5 С; оптимальная 22-25 С.Оптимальное значение рН среды при культивировании штамма на твердых питательных средах 6,2-6,4; на жидких средах 5,5. Растет на средах при значениях рН среды 1,4 - 8,0.Штамм не имеет маркерных признаков.Штамм обладает способностью к биосинтезу фузариевой кислоты, Содержание ее в культуральной жидкости 14-дневной культуры 84,9 мкг/мл, что в 2 раза выше, чем у известного штамма (50,8 мкг/мл).При выделении фуэариевой кислоты в чистом виде также выход приблизительно в 2 раза выше из штамма 690 - 10, чем из известного штамма.Штамм 690 - 10 хорошо растет на суслоагаре, картофельно-декстрозном агаре и на жидкой среде Чапека при поверхностном и глубинном культивировании. При выращивании глубинным способом мицелий и конидии распределяются по всему объему среды. При стационарном выращивании образуется плотная белая пленка мицелия на поверхности. На твердых и жидких средах характер культур одинаков,Признаки штамма устойчивы, Штамм хранят на сусло-агаре при 24 С под вазелиновым маслом 3-6 мес, затем пересевают.Получение препарата для инокуляции семян осуществляют выращиванием штамма на сусло-агаре в течение 14 сут при 24-26 С, затем отделяют выращенную культуру от среды, измельчают на гомогенизатоозе, разбавляют водой до титра спор 1 х 10, вносят в стерильный песок иэ расчета 50 г суспензии культуры на 500 г песка. Песок увлажняют стерильной водой до 70 - 80 ф влажности, Полученный таким образом препарат используют для инокуляции семян сои,Перед инокуляцией семена стерилизуют поверхностно 96 О-ным спиртом и розовым раствором КМп 04 в течение 2 минпоследовательно. затем промывают стерильной водой и помещают в инфицированный культурой песок на глубину 2 см,Семена проращивают в течение 5 дн прио24 - 26 С в термостате без дополнительногоосвещения, 1661206Патогенность выделенных из природы изолятов представлена в табл,1.Для дальнейшего повышения патогенности штамма проведена селекционная работа, которая включает следующие этапы:1) моноспоровый рассев исходного изолята на стандартной твердой питательной среде сусло- агар (рН 6,2 - 6,4) при 24 - 26 С, в качестве ингибитора роста колоний в среду добавляют 20 мл/л бычьей желчи;2) искусственное заражение 30 моноспоровыми клонами изолята 690 устойчивой к фузариозу линии сои к - 8409 и восприимчивого районированного сорта Букурия, врезультате чего. отобран наиболее патогенный клон 690 - 10 (табл,2). 3) проверка стабильности агрессивныхсвойств моноспорового клона 690 - 10 при десятикратном пассаже через растения.устойчивой линии к. Для этого искусственно заражают 100 семян сои внесением 10 г культуры гриба, полученной описанным способом при 24+.1 С. Через 7 дн подсчитывают процент развития болезни по поражению проростков по стандартной шкале и из больных растений изолируют культуру возбудителя, этот прием повторяют десятикратно. Полученные результаты представлены в табл.3.Моноспоровый анализ 10 генераций полученного штамма показал, что штамм не расщепляется по признаку патогенности.Фитотоксическую активность (способность к биосинтезу фузариевой кислоты),как одну из составляющих патогенности,определяют в культуральной жидкости 14- дневной культуры исходного штамма и полученного изолята 690-10. Грибы выращивают поверхностным способом вколбах на 500 мл (200 мл) при 24 С и рН 5,5на жидкой среде Чапека. Содержание фузариевой кислоты в культуральной жидкости составляет для исходного штамма 40,8 и полученного штамма 84,9 мкг/мл (табл,3).П р и м е р 1. Хранящуюся культуру штамма 690-410 рассеивают на твердую питательную среду сусло-агар (рН 6,2-6,4) и инкубируют в термостате при 24 - 26 С в течение 10 дн. Заражение осуществляют помодифицированному методу ЮА.Кепба апб К.Т. еаза, Для этого иэ семян сои испытываемых сортов, поверхностно обеззараженных 98-ным этиловым спиртом и затем водным раствором КМп 04 в течение 2мин, выращивают пятидневные растения в стерилизованном песке, увлажненном до 70 - 80; полной влагоемкости при 25 С без подсветки. Затем срезанные и промытые стерильной водой корни раскладывают в кюветы или чашки Петри с увлажненной 51015202530 3540455055 фильтровальной бумагой, на них помещают диски мицелия, которые вырезают сверлом с диаметром 1,5 см. По длине гниения корня при контакте с грибом на пятый день визуально оценивают устойчивость сорта согласно разработанной шкале.Так, сорт Букурия с длиной поражения корня 34,0 мм и Бельцкая - 82 (33,0 мм) являются сильновосприимчивыми, сорт Скынтея (15,0 мм) и Кишиневская(16,0) - средне- восприимчивым, линия к(9,0 мм) - устойчивой.В табл.4 дана шкала для определения устойчивости сортов сои при искусственном заражении штаммом 690 - 10.Таким образом, используя штамм 690 - 10 гриба Р.Охудозрогоа с высокой и стабильной патогенностью, можно охарактеризовать уровень фузариозоустойчивости сорта по величине пораженного участка корня; чем выше данный показатель, тем ниже устойчивость.П р и м е р 2. Определение фитотоксической активности,Штаммы (690 и 690 - 10) выращивают в стационарных условиях при 28 - 30 С в течение 14 дн на жидкой среде Чапека следующего состава, г: КМОз 2; КН 2 РО 1; МцЯО 4" 7 Н 20 0,5; КС 0,5; РеЯО7 Н 20 0,01; сахароза 30; вода 1 л; рН 5,0 - 5,5.По 10 мл питательной среды разливают в пробирки, засевают культурой штаммов и выращивают методом поверхностного культувирования. Полученную культуральную жидкость отделяют от мицелия центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин и доводят до рН 7 добавлением 1 н. раствора КОН. Содержание фузариевой кислоты определяют в полученном нейтральном растворе спектрофотометрическим методом, сравнивая интенсивности поглощения света подкисленным подщелочным растворами культуральной жидкости. Для этого к пробе 4 мл нейтрального раствора добавляют 1 мл 1 н, НС 04, Максимальное различие коэффициентов поглощения кислого и щелочного растворов обнаруживают при длине волны 274 мкм. Содержание фузариевой кислоты вычисляют по формуле: С мкг/мл = 39,3 Л Е х 274,где Е - разница экстинций подкисленного иподщелочного растворов,: содержащих фузариевую кислоту,Содержание фузариевой кислоты вкультуральной жидкости штамма 690 составляет 40,8 мкг/мл, у штамма 690 - 10 -84,9 мкг/мл.П р и м е р 3. Выделение фузариевойкислоты,1661206 30,1 о, соответственно для исходного и полученного), а также достоверно превышает все исследованные природные изоляты.Уровень содержания фузариевой кисло ты в культуральной жидкости штамма 690 -10 составляет 84,9 мкг/мл, что в 2 раза выше, чем у исходного(40,8 мкг/мл), Штамм 690 - 10 может быть использован в качестве продуцента фузариевой кислоты, необходи мой для проведения экспериментальных исследований с токсинами грибов.Использование штаммов, в частности690 - 10, обладающего высокой и стабильной патогенностью, дает возможность досто верной оценки уровня фузариозоустойчивости сортов при применении лабораторного метода искусственного заражения для ускорения селекционного процесса. 20 Формула изобретения Штамм гриба Гозагоа охузрогов (ЯсЫес 111) зпуб ет Напз ВНИИСХМ М 35 для определения устойчивости сои к фузариозу.Таблица 1 Величина поракения корня, мм Повторности 1Номериэолятр Х-а+х Реакциясорта 690 4,1812,42 31,0 26,0 25,0 + 1,87 34,0+ 5,55 31,0 30,0 26,0 36,0 35,0 30,0 22,0 55,0 139 230 + 05 1110 30,0 20,0 го,о 24,00 20,0 18,05,0 11,3 20,0 го,о 20,0 20,0 10,0 в 8,73 5,0 1 О,О 13,0 5,85 2,73 6,70 2,73439 1 О,О 40,0 1 О,О 1 О,О 20,0 630 25,0 25,0 1 г,о 15,0 20,0 10,0 150 1 О,О 15,0 10,0 365 200 20,0 5,0 20,0 20,0 5,0 5,0 1 О,О 1 О,О 5,0 76 25,0 25,0 18,0 20,0 15,0 0,8913,05,0 2,04 О,О 2,0 2,0 4,0 3,0 40,0 зо,о 1 О,О 10,0 20,0 10,0 5,0 1 О,О 10,0 445 5,70 20,0 20,0 25,0 зо,о 5,0 20,0 15,0 20,0 го,о 20,0 631 23,0+1,75 3,89 20,0 20,0 25,О 14,0 20,0 1,О О2,0 + 1,99 1,О 1,О 1,0 1,О 1,О 667 4,47 1 О,О ф Устойчивая линия,ФФВосприимчивый сорт. Штамм 690-10 выращивают, как описано в примере 2, Культуральную жидкость отделяют от мицелия фильтрованием через бумажные фильтры, подкисляют до рН 4,0 2 н. раствором НС 1, тщательно взбалтывают с этилацетатом, взятом в соотношении 1:5. Смесь отстаивают, отделяют этилацетат в делительной воронке и испаряют. Полученный осадок растворяют в небольшом количестве воды, подщелачивают 1 чаНСОз до рН 8 - 8,5. Препарат очищают, встряхивая дважды с половинным объемом эфира. Затем культуральную жидкость отделяют, снова подкисляют до рН 4,0, добавляют эфир в 5-кратном объеме и снова взбалтывают. Эфир сливают с испарительные чашки. После испарения эфира образуется экстракт, содержащий фузариевую кислоту.Эффективность штамма 690-10, Штамм 690 - 10 по патогенности превышает штамм 690 в 2 раза (интенсивность развития болезни по корневым гнилям 94,4 и 38,4 о, по поражению семядолей 58,4 и 3,0 +3,915 оф 58319,02 6,112,0 + 1,2217,О + З,О7,0 + 1,2220,0 + 1,962,0+0,428,0+ 58318,о+ г,гз22,0 +2,5419,0 +- 2,231661206 лина гниения ко ня, мм Устойчивая линия к10,0 10,0 10,0 1 1,0 10,0 12,0 13,0 10,0 10,0 2 д,О 10,0 10,0 10,0 10,0 15,0 10,0 10,0 15,0 10,0 10,0 10,0 15,0 15,0 20,0 15,0 15,0 15.0 15,0 15,0 10,0 Номер клонов 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Восприимчивый сорт Бк ия1661206 12 Таблица 4 Лабо ато ная о енка Полевой ин екционный он Развитие болезни,Иммунологическая характеристика обаз овИммунологическая характеристика обаз ов Длина гниения корня, мм1 - 10 0 - 25 26-50 51 - 75 11-20 21 - 30 31 и более 76 - 100 Составитель Т. ПолянскаяТехред М. Моргентал Корректор И. Муска Редактор Н. Яцола Заказ 2097 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Устойчивые Средневосприимчивые Восприимчивые Сильновосприимчивые