Способ определения повреждений бактериальной клети

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИ ЕТИЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(23) ПриоритетОпубликовано 2 9 (21) 2854 бб 1/28-1Ъвки Нов 12 Я 1/ Государственный комите СССР ло делам изобретений н открытий(71) Заявител истых ЕЛЕНИЯ ПОВРЕЛ(ДЕНИЯЬНОЙ КЛЕТКИ 4) СПОСОБ ОП БАКТЕРмикронию повьной клетИзвестен реждений ба проведения ний до и по дающего аге Однако и печивает вы Цель изо ности спосот 5 Изобретение относится биологии, а именно опреде реждений оболочки бактери ки способ определения цовтериальной клетки путемиохимических нсследовале воздействия поврежта 111.вестный способ не обесокой точности,ретения - повышение точа,Эта цель достигается тем, что способ определения повреждения бактериальной клетки осуществляют путем проведения биохимических исследований до и после воздействия повреждаю" щего агента, из исследуемых бактерий получают протопласты, определяют в них и в исходной клеточной суспенэии активность аденоэинтрифосфатов, воздействуют на обе популяции повреждающим агентом, повторно определяют в них активность аденозинтрифосфата и при увеличении их активности по сравнению с исходной в протопластах определяют повреждение бактериальной мембраны, а прн увеличении ее в бактериальных клетках определяют повреждение стенки бактерий.Способ осуществляют следующим образом.Бактериальную культуру клеток, подозреваемых на наличие в них микро- повреждений (опытная) и бактериальную культуру таких же клеток, не подвергавшихся какому-либо воздействию (контрольная), разделяют обе на две части, одну иэ которых пере"батывают в протопласты. Составляюрментные пробы, соответственнодержащие в одном случае только клетки, а в другом протопласты, а кроме того в обоих пробах аденоэинтрифосфат (АТФ) и ионы Мдф.Ферментные пробы инкубируют, останавливают ферментную реакцию добавлением в пробы хлорной кислоты, центрифугируют пробы и в надосадочной жидкости определяют содержание неорганического фосфата (Р) любым известным методом, например, по Амесу и Пюбину, Определяют также по методу Лоури концентрацию белка, вносимого в ферментные пробы в форме клеток и протопластов.Возрастание величин активности АТФ-аэы в клетках опытных проб при .равнении их со значением активностиПредлагаемый способ Клеточная мембрана Клеточная стенка Оболочка(недифференц) До После воз- воздей- действия ствия После До возвоздейст действия вия Послевоздействия До воздействия Послевоздействия До воздействияЗамоцаживаниеоттаГвание.1) 400 С/мин до -196 ОС-20 С (п=12) 0 74+ 34+ 5,7 3,4 2,43+0 12 1,25+0,03 1,87+0,21 0 АТФ-азы в контрольной пробе считают следствием наличия микроповреждений в клеточной стенке, а аналогичные сравнения, проведенные для прото- пластов - следствием повреждения клеточной мембраны.5Степень повреждения бактериальной оболочки выражают в единицах повреждения (ЕП).За 1 ЕП принимают повреждение оболочки бактерий, которое обуславли- ,1вает увеличение активности АТФ-азы на 100. Активность АТФ-азы рассчитывают в мкмоль Р/мг белка в 1 ч,Для нативной культуры (не подверг нутой воздействию повреждающего Фактора) активность АТФ-азы и нали чие микроповреждений в клетках и протопластах считают равными соответственно 100 и 0 (нуль) ЕП.Определение степени целостности оболочки микроорганизмов проводят на примере культуры бактерий Е.со 1 М.Для этого 0,5 мл плотноотцентрифугированных клеток бактерий дважды промывают 10 мм тряс-НСС буфером (рН = 7,8) посредством суспендирования клеток в 10 мл буфера и осаждения центрифугированием.Осадок клеток суспендируют в 11 мл буфера 11: 100 мм трис-НСЮ, рН 7,8 и 20 сахаровы и делят на две части, Из одной части обаемом 10 мл выделяют протопласты посредством прибавления к ней при постоянном помешивании раствора лизоцима (до конечной концентрации 150 Му/мл, смесь инкубируют при 37 С в течение 15 мин и смешивают с 1 М раствором ЭДТА в соотношении 10;1 Ч/ч, и инкубируют при том же режиме в течение 15 мин.Процесс завершают дробным центри фугированием: смесь центрифугируют при 3500 у в течение 10 мин, 1/2 часть верхнего слоя отсасывают и снова центрифугируют при 400 у в течение 20 мин.Осадок, содержащий 90-100 протопластов, отделяют от надосадочной жидкости и суспендируют в буфере 11.Составляют ферментные пробы из: 1,2 мл 1,25 мл МуСС, 0,2 мл суспензии клеток (протопластов) и 0,6 мл раствора АТФ 2,5 ш М (рн 6,9-,7,8). Параллельно составляют и одну контрольную пробу: те же ингредиенты, что и в ферментных, но только вместо клеток (протопластов) - 0,2 мл буфера 11. Пробы инкубируют 30 мин при 37 С и отрабатывают 0,3 мл 20-нойохлорной кислотой, центрифугируют при 7000 в течение 5 мин,надосадочную жидкость отсасывают и анализируют на количественное содержание в ней неорганического фосфата (Р) методом Амеса и Дюбина в модификации: 1 мл надосадочной жидкости смешивают с 2,0 мл свежеприготовленной смеси (1 часть 10-ного раствора аскорбиновой кислоты и 6 ч. 0,42 -ного раствора молибдата аммония в 1 И растворе серной кислоты), Пробы инкубируют 30 мин при 37 С; охлаждают в ледяной бане и анализируют на оптическую плотность (против контрольной пробы) при 660 нм.Сравнительные результаты известного и предлагаемого способа представлены в таблице. Характеристика величины повреждений оболочки бактерий (клеточной стенки и клеточной мембраны) различными повреждающими Факторами осуществлена предлагаемым Способом и известным, данные в единицах повреждения (ЕП),Предлагаемый способ Клеточная стенка Клеточная мемб рана Оболочка(недифференц) До После воз в воз - дейст- дейВия ствия До воздей- Послествия воздействия воз- После йствия возде ствияПослевоздействия До воздействия ХимическоевеществоМол.вес.266,гидрофобнойприроды (п=Змг Ъ0,04 Неопр. 93 11,8,5 5,0 тиля)да =комн,1 Вода (дис лированна (культ:во1 ФЗ Ч/Ч (п=1), вр контакта 0 Неопр5 1 09 24 ч). бнаружено. тем, что, с целью повышения точностиспособа, из исследуемых бактерийполучают протопласты, определяютв них и в исходной клеточной суспензии активность аденозинтрифосфатов,воздействуют на обе популяции повреждающим агентом, повторно определяютв них активность аденоэинтрифосфатови при увеличении их активности посравнению с исходной в протопластахопределяют повреждение бактериаль.ной мембраны, а при увеличении еев бактериальных клетках определяютповреждение стенки бактерий.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Ягапке ВЕ. Зпдцсед епгущеяупЬея 1 з 1 падгеопз зизрепз 1 оп ойзгогей Заг 1 опагу ржаве.-АегоЬасгегаегодепеяИацге. (опйоп, 1961,ч. 191, рр, 1242- 1273. мый спосо точност формула иэобретени б определения иальной клетки пуимических исслевоздействия пово т л и ч а ю щ Спос бактери ния био и после аента, вреждения ем провед ований до еждающего и й с я Составитель С. Малютинако Техред Т.Маточка Корректор М, Демчи Редактор В. Лаза 528рственного комите зобретений и откр Ж, Раушская на акая 7149/4 Подпи а СССРытийу де е Тираж ПИ Госуд о. делам Москва, Н 11303 илиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 повреждений после воздействий н Как видно из представленной табицы, экспериментальные данные по Я онтролю целостности оболоч к актерий, полученные с помощью предагаемого способа, оказались более очными, информативными и объективыми по сравнению с данными, полуенными с помощью известного спосоа.Предлагае б обеспечивает олее высокую ь и информативость. Известный спо- Выживаемостьсоб 8млрд/мл