Способ получения ферментного препарата -маннаназы

Союз Советских Социалистических РеспубликОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУДополнительное к авт,свид-в.07(088.8) ата опубликования описания 230881,-Г.А. Фиранта о-исследовательский институтэнзимологии 71 Заявитель Всесою й нау ладно р 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТ -МАННАНАЗЫ Изобретение относится к микробио логической промышленности и может быть использовано для получения высокоочищенного ферментного препарата -маннаназы, продуцируемого бактерия.ми Вас 1 Иця яцгс 1 с 1 я.Известны способы получения ферментного препарата-маннаназы,путем культивирования различных микро" оргаииэмов в лабораторных условиях, в частности Аярегу 116 ця п 1 дег и ВасИСця яцгс 161 я.ферментный препарат р-маннаназы получают путем культивирования Аярегд 1 ВЙця п 1 дег с последующим выделе нием фермента высаливаннем сернокислым аммонием и диализом или обессоливанием на колонках с сефадексом.6-25, многократной хроматографией на анионитах н катнонитах 1. 20Недостатками способа являются его многостадийность и трудоемкость, а также невысокий выход продукта(менее 40),в пособ ные соли, в тещим выделениемральной жидкоссернокислым амдиалиэом осадкментного раствчерез колонкуАи повторнымкислым аммонием 2),Выходпродукта . 62 .Однако известный способ полу"чения ферментного препарата-маннаназы имеет недостаточно высокийвыход продукта, большую продолжительность культивирования и многостадийность очистки ферментного препарата с использованием дорогостоящих реактивов.Цель изобретения - повышение выхода ферментного препарата -маннанаэы, удешевление и упрощение технологической схемы и ускорение процесса.Указанная цель достигается тем,что в известном способе полученияферментного препарата-маннаназы,в качестве продуцента из вида ВасЩ ця яцХс 161 я используют штаммВас 1 Ицв яцгс 161 я С, культивирование проводят в течение 16-20 чна питательной среде, содержащей исляется с препарат тивирова 1 С 1 я Ксодержащ а и мин я й исраль Наиболее близким я получения ферментного Р-маинанаэы путем куль бактерий Вас 1 ССця яцгс на питательной среде,точники углерода, азотчение 45 ч с последую фермента из культути путем высаливания монием, последующим а, деколоризацней фер ора, пропусканием с анионитом Рцос 1 севысаливанием серно 857263точники углерода, азота и минеральные соли, выделение фермента осуществляют путем осаждения трехкратным объемом этилового спирта прирН 5,0-5,2 и температуре 2-4 С иофлокуляцией с помощью полиакриловойкислоты при рН 4,3-4,4 в соотношении.полиакриловая кислота:белок0,06:1 с последующим осаждениемфлокулянта раствором хлористого кальция при рН 6,2-7,0 и лиофилизациейполученного ферментного раствора.Кроме того, раствор хлористогокальция используют в 10-50-ной кон-центрации.Существенными отличиями предлагаемого способа являются использование 15в качестве продуцента штамма Вас 110 цвяцй 111 1 я С, проведение культивирования в течение 16-20 ч и условиявыделения Фермента из культуральнойжидкости, 20Предлагаемый способ позволяет достичь выхода целевого продукта до 79,Средняя активность ферментногопрепарата-маннаназы 540 10 ед/гпрепарата. 25Предлагаемый способ полученияпрепарата-маннаназы являетсяпростым в практическом применении,менее продолжительным, позволяетполучить Ферментный препарат-маннаназы высокой степени очистки и схорошим выходом. Способ не требуетприменения дорогостоящих ионитов итехнологически сложных и длительныхстадий хроматографии. Это дает возможность снизить трудоемкость процесса получения препарата Р -маннаназы и значительно его удешевить.Предлагаемый способ легко может бытьмасштабирован в производственНЫх условиях, 40Способ осуществляется следующимобразом.В качестве продуцента -маннаназы используют штамм Вас 1 Иця вцйЫ 1 Ив6-78, засев продуцента производят 45при рН 6,7 + 0,1, культивированиепроводят при 37 дС, продолжительностькультивирования 18 + 2 ч.По окончании роста культуры биомассу отделяют фильтрацией. Фильтрат 5 Оподкисляют разбавленной уксуснойкислотой до рН 5,0-5,2 и осаждаюттремя объемами э"илового спирта. Осаждение проводят охлажденным этиловымспиртом при 2-4 С. Осадок собираютфильрацией или центрифугированием,после чего растворяют в минимальномколичестве подкисленной уксуснойкислотой до рН 4,3-4,4 воде и производят флокуляцию 1 раствором полиакриловой кислоты. Флокуляцию проводят при комнатной температуре. Образовавшийся осадок отделяют центриФугированием или фильтрацией. Полученный осадок растворяют в воде исухим углекислым натрием доводят 65 рН до 6,5. После этого флокулянт осаждают 20-ным раствором хлористого кальция. Осажденный флокулянт отделяют центрифугированием, а полученный ферментный раствор лиофильно высушивают.П р и м е р. Для получения высоко- очищенного ферментного препарата- маннаназы в качестве продуцента используют штамм ВасДЕ ця яцй 1 Г 1 я 6-78, Питательную среду готовят следующего состава,: крахмал - 6,5; кукурузный экстракт - 2,7; сухие пивные дрожжи -0,12; (ИН 4) НРО) - 0,5; КЯО 4 - 0,33; МЦЯО 4. 7 НО - 0,016; МпЯО 4 - 0,1 р СаСГ - 0,013, Культивирование проводят на бродильных установках типа Биолафит. Для охлаждения этилового спирта используют холодильную установку Ультракриомат. Стерильную питательную среду при 45 С, рН 6,7 засевают штаммом ВасМРцв яцй 1111 в 6-78. В течение двух часов температура снижается до 37 ОС, которую и поддерживают во время всей ферментации, В начале ферментации рН снижается до 6,1+0,1, потом повышается и в дальнейшем рН автоматически поддерживают в пределах 6,4-6,6. Продолжительность ферментации 18 + 2 ч. Конец ферментации определяют по максимальной ферментативной активности Р-маннаназы. за условную единицу активности принято такое количество Фермента, которое уменьшает относительную вязкость галактоманнана (полигалактоманнан из семян Сега 1 оп 1 а я 1 Г 1 Чца, Фирма Я 19 тпаф, СИЛ) на одну миллиединицу за одну минуту при 40 С.По окончании Ферментации культуральную жидкость охлаждают до 10 С и отделяют биомассу фильтрованием. К 10 л охлажденного до 2 С и подкисленного разбавленной уксусной кис лотой до рН 5,0-5,2 фильтрата постепенно добавляют 30 л охлажденного до -20 ОС этилового спирта. При этом температуру смеси поддерживают около 2 С. Образовавшийся осадок отфильтровывают и промывают одним литром этилового спирта, Далее осадок растворяют в 1 л воды, подкисленной уксусной кислотой до рН 4,35, и добавляют флокулянт (1 раствор полиакриловой кислоты) из расчета 0,06 мг ПАК на 1 мг белка.Полученный осадок центрифугируют 30 мин, 6000 об/мин, Далее осадок растворяют в 100 мл воды, предварительно подщелачивая до рН 6,5 сухим углекислым натрием. К полученному раствору добавляют 20 раствор СаСЮ иэ расчета 0,78 вес.ч. СаСВ на 1 вес.ч, ПАК. Осажденный Флокулянт отделяют центрифугированием/ аименование Общтадии ти Степень Выхоочйстки Ъ е Фильтр (10 л) 17 10 20 34 Послеосаждения этнолом 2,2 10 1441 3 18 1 После флоку ляции с ПАК 84 1 5 31,После лиофи зации 500 54 а изобретения соотношении полибелок 0,06:1 ждением флокулянта ого кальция при илизацией полученраствора. 1, о т л и ч а юто раствор хлорисольэуют в 10-50 В-ной1. Способ получения ферментного препарата -маннаназы, предусматривающий культивирование продуцента вида Вас 1 ВВие ецй 1 В 1 е на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, и выделение фермента из культуральной жидкости, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, упрощения, ускорения и удешевления процесса, в качестве продуцента иэ вида ВасНВцв вцй 11 В 1 в . используют штамм Вас 1 ВВие вцй 11 В 1 в 0-78, культивирование проводят в течение 16-20 ч, выделение Фермента осуществляют осаждением треккратным объемом этилового спирта при рН 5,0- 5,2 и температуре 2-4 ОС и флокуля цией с помощью полиакриловой кислоты тогкон1 информ ние пр ии,экспертиава К.,1 Ка асс и Иоде д 1.55 161Оп 1 Ь 1 го РцКщпой Сг 1 в 1 а И 1 ва 11 оп в ой Маппапаве. - .1972, чоВ,36," отип),ставитель О. Скородумовахред .Т,Маточка Корректор М Редактор В. Лазаренко Тираж 528 ВНИИПИ Государст по делам изобр 13035, Москва, Жаказ 7149/4 Подписноенного комитета СССРений и открытийРаушская наб., д. 4/5 Филиал ППП Патент 1, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 20 мин, 8000 об/мин, а полученныйферментный раствор лиофильно высушивают. Средние показатели процесса получения высокоочищенного препарата р-маннаназы представлены в таблице. при рН 4,3-4,4 в акриловая кислот с последующим ос раствором хлорис РН 6,2-7,0 и лио ного ферментного 2. Способ по щ и й с я тем,о кальция исп центрации.