Способ получения модифицированнойрибонуклеиновой кислоты

ВЮ 725 Союз Советских ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН И Я К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(51) М КлС 07 Х 21/00 с присоединением заявки Лев Государственный комитет(45) Дата опубликования описания 07.03.81 ло делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Б. М. Куриненко, Р. Э, Давыдов и ф. ф. Шаги-Мухаметова Казанский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. В. И. Ульянова-Ленина(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕИИЯ Модиф ИЦИРОВАХ НОЙ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ1Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в энзимологии при исследовании ферментов нуклсинового обмена и при получении иммо билизованных ферментов.Полимерные лиганды, специфически взаимодействующие с активным центром фермента, являются чрезвычайно полезным инструментом для аналитического исследования каталитических свойств ферментов и для решения ряда прикладных задач. В частности, возможно их применение для зашиты активного центра при иммобилизации ферментов, Это дает возможность ориентировать иммобилизацию и увеличить выход иммобилизованных фсрмснтов по активности.Одним из походов для создания таких лигандов является ковалентное связывание с полимерным носителем субстрата, сохраняющего после связывания способность к взаимодействию с ферментом,Известен способ получения иммобилизованных нуклеиновых кислот путем ковалснтного связывания их на холоду в течение 30 мин с растворимым полимером декстрана полиглюкином с помощью цианурхлорида обработкой смеси нуклеиновой кислоты (РНКили ДНК) и полиглюкина ацетоновым раствором цнанурхлорида для ЗО олучсния на их основе аффинного сорбента, взаимодействующего с нуклеазами без существенного выщелачивания нуклеиновой кислоты 11.Помимо целевого продукта в качестве побочного продукта реакции получают модифицированные нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), являющиеся водорастворимыми высокомолекулярными лигандами нуклеаз (выход менее 20%) и представляющие большой практический и теоретический интерес.Данный способ осуществляется следующим образом. К 0,3%-ному раствору рибонуклеиновой кислоты в 5%-ном растворе декстрана добавляют по каплям на холоду ацетоновый раствор цианурхлорнда до конечной коннснтрацн 2%. В процессе добавления раствора цианурхлорида образуется белый гель. Нерастворимый конечный продукт - - олисахарид, ноперсчно сшитый с нуклеиновой кислотой, отмывают от исходных нспрорсагировавших компонентов и используют в качестве аффинного сорбента, Полученный по описанному способу лиган,; нерастворим, что ограничивает его применение областью аффннной хроматотрафин Выход же растворимого лнгандамоди.фицирова нных нуклеиновых кислот недостаточно высок (менее 20 со).Целью изобретения является увеличс.ние выхода растворимого лиганда, а такжеотделснис сго от побочных про;дуктов синтеза.Поставленная цель достигается согласно описываемому способу получения модифицированной рибонуклеиновой кислоты,заключающемуся в связывании РНК с полиглюкином с помогцью пианурхлорида втечение 24 ч при 20 - 25 С путем обработки 1,5 - 2/о смеси РНК и полис лсокинаацетоновым раствором цианурхлорида (прнконцентрации его в смеси 0,05 - 1%), с последующим удалением водонерастворимыхпродуктов реакции, диализом против0,05 М трис-НС 1 буфера рН 7,0 - 7,5 и сслективнььс извлечением целевого продуктааффинной хроматографией.Существенными отличиями данного способа являются низкие концентрации реагирующих веществ, условия связывания - втечение 24 ч при 20 - 25 С, диализ н селективное извлечение целевого продукга, про.водимыс в указанных выше условиях.При осуществлении способа весовое соотношение РНК и полиглюкина обычно составляет 1: 10, а в качестве аффинногосорбента используют рибонуклсазу, иммобилизованную на оксиэтилсульфониланп.золцеллюлозе.Описываемый способ обеспечивает более высокий выход модифицированнойРНК, а также высокое качество продукта.достигаемое за счет применения в целяхочистки и выделения афинной хроматографии,Модифицированная Р 1-1 К, получаемаяописываемым способом, сохраняет способность к повторному взаимодействию с ферментом и может быть использована в качестве специфического ингибитора 1 Ч 1 КазыМолекулярный вес лиганда может колебаться в широких пределах (в зависимостиот молекулярного веса носителя), это может быть использовано для получениякомплексов пнгибитор-РНКаза и ьыделения фермента из сложной смеси белков сблизкими физико-химическими свойствамиметодом эксклюзионной хроматос рафии.Способность образовывать достаточнопрочные комплексы с ферментом можетбыть использована для защиты активногоцентра фермента при его иммобилизации,При этом увеличится выход иммобилизованных ферментов.по активности и, естест.венно, возрастет экономическая эф:.ректив.ность иммобилизации. Иммобилизованныена растворимых носителях ферменты обладают более высокой биологической активностью, и их целесообразно использоватьв качестве лекарственных препаратов посравнению с нативными ферментами.Пример 1, 500 мг полиглюкина раство 5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4ряют в 25 мл 0,1 М боратного буфера, рН 9,2, в полученном растворе растворяют 50 мг РНК, смесь охлаждают до 5. Далее добавляют 10 мл охлажденного раствора цианурхлорида в ацетоне (2,5 мг/мл). Температуру смеси доводят до комнатной, выдерживают в течение 24 ч. Водонерастворимые продукты отделяют фильтрованием. Водорастворимый продукт, выход которого составляет более 40/о, далее отдиализовывают против 0,05 М трис-НС 1 буфера, рН 7,0 - 7,5 до удаления низкомолекулярных примесей, поглощающих при 260 нм.Диализат наносят на колонку с иммобилизованной на оксиэтилсульфониланизолцеллюлозе РНКазой в соотношении 25 опт. сд. на 100000 ед. акт. иммобилизованного фермента. Активность исследуют методом определения продуктов гидролиза РНК, растворимых в кислом растворе уранилацетата (конечная концентрация - 0,12/о уранилацетата в 4/о НС 10 с). За единицу активности принимают количество фермента, образующего 1,0 опт. ед. кислоторастворимых продуктов гпдролпза РНК в течение 1 часа инкубацпп реакционной смеси. Колонку промывают 0,05 М трис-НС 1 буфером рН 7,5 и водорастворимый лиганд РНКазы элюируют 0,2 М ацетатным буфером, рН 5,2.Пример 2. Использование модифицированной РНК в качестве ингибнтора РНКазы.Ингибирующсс действие модифицированной РНК (высокомолекулярного лиганда) определяют по торможению реакции гндролиза РНК в присутствии модифицированной РНК с помощью метода измерения количеств кислоторастворимых продук. тов гидролиза,Реакционную смесь, состоящусо из 0,1 мл РНК (концентрация 1 мгlмл), 0,1 мл фермента - панкреатической РНКазы и 0,1 мл ингнбитора, инкубируют при 37 С в течение 5, 10, 15 мин. Затем к ней при охлаждении (ОС) добавляют 0,3 мл 0,075/сного раствора уранилацетата в 10/о-ной хлорной кислоте. Смесь выдерживают на льду в тсчснис 10 мин. Далее добавляют 1,9 мл 2,5/о-ного раствора хлорной кислоты и отделяют осадок цснтрифугированисм при 7000 об/мин в течение 1 О мип. Оптическую плотность надосадочнойс жидкости измеряют при 260 нм. За единицу активности принимают количество фермента, образующего 1,0 опт. единиц кислоторастворимых продуктов гидролиза РНК в течение 1 ч инкубации реакционной смеси. Наличие в реакционной смеси модифицированной РНК в соотношении к натиг; ной, как 1: 20, вызывает торможение реакции гидролиза на 50/ю,810725 Составитель О, Скородумова Техред А. Камышникова Корректор О. Силуянова Редактор Л. Курасова Подписное Тираж 419 Изд. М 235 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб, д. 4/ЬЗаказ " . Загопская типография Упрполиграфиздата Мособлисполкома 5 Формула изобретения1. Способ получения модифицированной рибонуклеиновой кислоты (РНЕ,) путем .обработки смеси РНК и полиглюкина ацетоновым раствором цианурхлорида, отлпч а и щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, используют цианурхлорид при концентрации его в реакционной смеси 0,05 - 1 о, РНК и полиглюкина 1,5 - 2/о, связывание осуществля 1 от в течение 24 ч при 20 - 25 С с последующи удалением водонерастворимых продуктов 1 геакции, диализом против 0,05 М трис-НС 1 буфера, рН 7,0 - 7,5 и селективны извле:бчением целевого продукта аффинной хроматографией.2. Способ по и. 1., о т л и ч а ю щ и й с ятем, что весовое соотношение РН 1 и поли глюкина в реакционной смеси составляет1: 10.3. Способ по и. 1, отличающийсятем, что в качестве аффинного сорбента используют рнбонуклеазу, иммобнлизован ную на оксиэтижулъфониланизоцеллюлозе.Источники информации,принятые во вншгание прп экспертизе1. Авторское свидетельство ССС РМо 618380 кл С 67 Н 21100, 1.976 (про тотип).