Способ получения ингибитора фосфолипазы с

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет Государственный комитет СССР по делви изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Всесоюзный научно-исследовательский технологическийинститут антибиотиков и ферментов меДицинскогоназначенияИзобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в медицине.Известен способ получения ингибнтора фосфолипазы С(.1 озсгЫ 1 ап регйг 1 п.5 депе из крови иммунизированных лошадей 13 .Однако известный способ не обеспечивает высокой детоксицирующей активности целевого продукта, так как антитоксические сыворотки для профилактики не используют, а эффективность серотерапии недостаточна,Целью изобретения является повышение детоксицирующей активности 15 целевого продукта. Эта цель достигается тем, что штамм БсгерСочегс 1 с 1111 цв щусойерс 1 п 1 сшпвыращивают на питатель ной среде, содержащей источники углерода, азота и минимальные соли, нативный раствор освобождают от примесей последовательным пропусканием через анионит ФАФ в хлоридной форме, 25 подкислением до рН 5,3-5,5, прогреванием при 50-55 С, обработкой сульфатом аммония до 55-60 насыщения, отстаиванием при 4-10 С в течение 18-20 ч, центрифугированием ультра- иО диафильтрацией супернатанта, затемлиофильно высушивают и очищают отпротеаз,Способ осуществляют следующим образом,Производят обработку нативногораствора 81 ч. щусоЬерс 1 п 1 сцтп анионитом ФАФ (коэффициент набухания 4,2) в хлоридной форме в динамических условиях с целью частичного освобождения от балластных белков, пигмента и антибиотика микогептина. После этого подкисляют полученный раствор до рН:5,5-5,3, прогревают в течение 30 мин при 5055 С с целью частичной кислотной итепловой денатурации ряда балластныхбелков, в том числе протеаз,Высаливают ряд балластных белков,в том числе протеаз сульфатом аммония (55-60 насыщения). Осадок формируется при 4-10 С в течение 18-20 ч,затем его центрифугируют,Осуществляют ультра- и диафильтрацию супернатента через ацетилцеллюлозную мембрану УАММ с диаметром пор не более 150 А и удельной скоростью фильтрации пэ воде не734260 йроницаемую для минеральных солей.(в частности, сульфата аммония), взначительной степени проницаемуюдля пигмента и задерживающую ингибитор на 90"80, Лиофильно высушивают деминерализованный концентрат, по"лученный в результате ультра- и диаФильтрации.Таким образом, получают препаратингибитора полностью очищенный отнтибиотика микогептина, минеральных солей, ряда балластных белковк пигмента. Препарат содержит ингибитор фосфолипазы С с примесью протеаэы,С целью полной очистки ингнбитора далее проводят либо гель-хроматографию препарата на сефадексе8-50 21 пе,используя в качестве элюента 0,0005 М Фосфатный буфер (рНе 7,0),либо,изоэлектрическое Фокусированиев градиенте плотности.Полученные в результате гельхроматографии фракции, характеризующиеся ингибирующим действием наФосфолнпазу С, не содержащие пРотеаэу, лиофильно высушивают.Аналогичные фракции, полученныев результате иэоэлектрического Фокусирования, перед лиофилизацией освобождают от амфолина и сахарозц ультрафильтрациея через ацетилцеллюлоэную мембрану УАМи с диаметромпор 120 А.Полученный высокоочишенный ингибитор Фосфолипаэы С прн содержании0 65 мг белка/мл характеризуетсяф60 ингибиции О 16 мг белка/мл - 26ингибиции.Выделенный ингибитор Фосфолипаэы С является веществом белконойприроды, гомогенный при диск-электроФорезе в полиакриламидном геле прирНе 8,3. Молекулярная масса ингибитораопределенная методом гель-хроматографии, составляет 3500-4000. Прииэоэлектрическом,фокусировании вградиенте плотности ингибитор разделяется на 2 иэоформы с изоэлектрическими точками 8,50 и 8, 15.Нативнцй растнор пропускают соскоростью 90-100 мл/чсмчереэ коАфлонку, загруженную 6 г анионита ФАв хлоридной форме с коэффициентом набухания 4,2. Анионит в значительной степени сорбирует антибиотикмикогептин, пигменты, частично балластные белки 1 в том числе протеазу,Полученный раствор подкисляют дорН а 5,5, прогренают 30 мин при 55 С,быстро охлаждают до комнатной температуры. Затем проводят высаливаниебалластных белков, в том числе55% -ЬО протеаэ сульфатом аммония до 55насыщения (351 г на 1 л). После формированйя бсадка на холоду в течение18 ч осадок отделяют центрнфугироэанием и отбрасывают, Полученный 65 супернатант помешают в ультрафильтраУльтрафиолетовый спектр ингибитора я вляется характерным для белков,0 максимум поглощения 278-28Таким образом, выделенный ингибитор Фосфолипазц С является основным полипептидом с мол. массой 33500"4000.Активность йнгибитора фосфолипаз ы определяют по угнетанию специ Фического гидролиэа фосфатидилхоилхолина (лецитина) в лецитевителлине методом диффузии в агар и серийном разведеВ первом случае учитывают вели) во вто чину эоны приципктации (6 мм), ром титр. Обсчет эффекта ведут по сравнению результатов в контроле к опыте по формуле 100, где А- вффект в контроле, В - эффект в опыте. Показано, что выделенные образцыобладают ингибиторной активностьюв отношении фосфолипазц С С 1 регйг 1 пцепв типа А.ЗД составляла (по белку) 0,55 мг/мл, л Д " 1,1-1,15 мг/мл,Связывание в выбранной системе(вода, иэотонический раствор, хлорида натрия, 0,005 М фосфатный буфер)было необратимым. Белки сыворотки крони на активность ингибитора не влияли,Токсичность лиофильно высушенного 0 ингибитора не содержащего биологически активные примеси, излучалив опытах на салицах белых мышей породы БНН весом 18 г. Препарат вводили однократно, внутрибрюшинно и 5 внутривенно (в хвостовую вену мышей)н иэотоническом растворе хлорида натрия в объеме 0,5 мл. Наблюдение заживотными вели в течение 10 сут, Учитывали выживаемость, активность и 20 вес животных. Использованы следующие дозы ингибитора по белку 1, 1 мг/чышь и 0,55 мг/мышь, что соответствовало 100 и 50-нцм ингибиторным концентрациям, Эа срок наблюдения группы животных, получавших однократноингибитор внутривенно и внутрибрюшинно, были живы, активны и не теряли ввесе (нес контрольной группы через10 сут. 191,1 г, опытных соответственно 18,8+0,8 и 19,311,0 г. При контрольном вскрытии онцтных мышей,забитых на 11 сут. после введенияингибитора, макроскопических изменений не выявлено.П р и м е р 1, В качалочные колбы З 5 емкостью 750 мл, содержащие 50 млсоево-кукурузной среды, вносят 5 млпосевной культуры, выращенной в дечение 2 сут. при 28 С на среде, г/лсоевая мука 20, глюкоза 20, хлорис тый натрий 1. Культивирование проводят в течение 5 сут. По окончании процесса ферментации культуральную жид"кость сливают, центрифугируют при3000 об/мин в течение 30 мин, Получают 300 мл натинного раствора, в котором содержался ингибитор.6 734260 Формула изобретения Составитель С, Малютина Редактор Н. Потапова Твхред Я,Бирчак Корректор Г.РешвтникЗаказ 2007/35 Тираж 522 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП Патент, г. УжГород, ул, Проектная, 4 ционный аппарат периодического действия с перемещением. В качестве ультрафильтра используют селективно подобранную мембрану УАММ, характеризующуюся диаметром пор не выше 150 А,удельной скоростью фильтраций поводе не выше 2,010 мл/мин хсматм. Мембрана полностью проницаема для минеральных солей, в значительной степени для пигмента и задерживает ингибитор на 80-90. Концентрирование проводят при давлении 2,5 - О 3,0 атм. Затем проводят в этом же аппарате 3 диафильтрации при давлении 2,5-3,0 ати до полного обессоливания с последующим концентрированием. Концентрат лиофильно вы сушивают, затем растворяют в 2 мл фосфатного буфера и наносят на колонну, заполненную сефадексом СЕ 1 пв (1,0 х 60 см) уравновешенную 0,005 М фосфатным буфером (рН 7,0). Злюцию 30 проводят этим же буфером со скоростью 12 мл/ч. фракции, характеризующиеся ингибирующим действием на фосфолипаэу С, не содержащие протеаэу и другие балластные вещества, лиофильно высушивают, иэ 300 мл нативного раствора выделяется 29 мг высоко- очищенного ингибитора.П р и м е р 2300 мл нативного раствора получают и обрабатывают также, как описано в примере 1 (обработка ФАФ, подкисление, прогрев, высаливанне, ультра- и диафльтрация супернатанта, лиофильное высушивание). Далее проводят изоэлектрическое фокусирование в градиенте плотности лиофильно высушенного препарата. Фракции, обладающие ингибирующим действием на фосфалипазу С, не содержащие протеаэу, освобождают-от амфолинов и сахарозы диафильтрацией через ацетилцеллоэную мембрану УАММ и лиофильно высушивают. Иэ 300 мл нативного раствора выделяется 40 мг высокоочищенного ингибитора.Предлагаемый способ обеспечивает высокую детоксицирующую активность целевого продукта, что позволит снизить количество случаев тяжелых осложнений при травмах н ранениях. Способ получения ингибитора фос-.фолипаэы С С 1 овтгЫ 1 цщ регЮг 1 пдепв,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения детоксицирующейактивности целевого продукта, штаммЯСгер 1 очег Мс 111 ап щусопер 11 п 1 сцщ 255 выращивают на питательной сре-.де, содержащей источники углерода,азота и минеральныесоли нативныйраствор освобождают от примесей пос"лвдовательным;пропусканием черезанионит ФАФ в хлоридной форме, подкислвнием до рН 5,3-5,5, прогреванием при 50-55 С, обработкой сульфатом аммония до 55-60насыщения, отстаиванием при 4-10 С в течение 18-20 ч, центрифугированиемультра- ы диафильтрацией супернатанта,затем лиофыльно высушивают и очищаютот протваэ.Источники информации,принятыв во внимание при экспертизе1. Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов.М., Медицина, 1975, с. 95-96.