Способ выделения рибонуклеазы

Сюз Соаетсииж Социаяистическик Республик(22) Заявлено 1104 т 7 (21 с присоединением заявки И 8-1 3 24733 13 10 осударствеиный комитет СССР по аелам изобретений и открытийата опубликования описани 5 1 2) Авторыизобретен В.А. Ежов П(71) Заявитель нститут биохимии и Физиологии микроорганизмов АН СССР(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РИБОНУКЛЕАЗ являющий" ким реше- триваю- туральию полурас 1 цт, техниче предусм ние кул фильтра лиз 21 ни щи но че редусмаой риболяетсяполучит Извес нуклеазыИзобретение относится к микробио логической промышленности, а именно к способу выделения рибонуклеазы, используемой в пищевой промышленнос 5 ти для удаления РНК из белкововитаминных концентратов и. улучшения их пищевой ценности, в медицине, а также в биохимических синтезах полинукле. отидов и их исследованиях, изучения. строения рибонуклеиновых кислот и белков.Известен способ выделения и очистки щелочной РНКаэы из культуральной жидкости Реп 1 с 1 е 61 шп Ьгеч 1 согпрасцтп согласно которому для получения щелочной РНКазы из культуральной жидкости осаждают ферменты .сульфатом аммония при 0,9 насыщении, осадок отделяют на суперцентрифуге, растворяют, повторно центрифугируют и диализуют, Раствор после диализа очищают хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, КМ-целлюлозе и сефадексе 6-75. Перед каждой стадией хроматографии растворы с Ферментом концентрируют и диализуют, Концентрат щелочной РНКазы хранят при +4 С или при - 5 С в глицерине 1).о способ выделения рибокультуральной жидкости ЗП ько, И,О. Лишевская и Б,П, Мори Реп 1 сИ 41 цщ Ьгеч 1 сощся наиболее близкимем к изобретению,й хроматографировай жидкости, ультранного элюата и диаОднако известный способривает получение только кинуклеаэыр при этом способ-абот,;.;.ооным и не поэволяебольшие количества. Фермент Целью изобретения является разработка промышленного способа получения кислой и щелочной рибонуклеазы в одной технологической схеме, повышение степени их чистоты, упрощение процесса и повышение выхода целевого продукта .Поставленная цель достигается тем, что хроматографирование культуральной жидкости осуществляют в три стадии, на первой из которых культуральную жидкость пропускают через последовательно установленные среднеосновной и высокоосновной аниониты, после чего злюат концентрируют ультрафильтрацией и диализуют, на второй стадии полученный раствор хроматографируют на КИ-целлюлозе, концентрируют ультрафильтрацией и диалиэуют, затем на третьей стадии проводят гель-хроматографию на сефадексе 6-75 с получением двух Фракций, одну иэ которых, содержащую кислую рибонуклеазу, диализуют и сушат, а другую - щелочную рибонуклеазу - концентрируют ультра- Фильтрацией и кристаллиэуют диализом.При этом в качестве среднеосновного анионита используют смолу ЭДЭП в С 1 -форме, а в качестве высокоосновного анионита - анионообменное волокно ЦМ-А 2 в С -Форме.Сущность способа заключается в следующем.Отфильтрованную культуральную жидкость Реп 1 с 1111 цв Ьгеч 1 сощрасца пропускают с высокой скоростью сначала через колонку со среднеосновным анионитом, например ЭДЭП, где удаляются сильнокислотные примеси, затем через колонку, заполненную высо коосновным анионообменным волокном на целлюлозной основе, например ЦМ-А 2. Насыщенную Ферментом колонку промывают водой и десорбируют ферменты 0,5 н. 1)аС 0 в 0,1 н. ацетатном 25 буФерном растворе с рН,0. Активные элюаты концентрируют ультрафильтрацией, диалиэуют, хроматографируют на КМ-целлюлозе и сефадексе С. После сефадекса 6-75 получают гомогенные фракции кислой и отдельно щелочной рибонуклеаэ. Выход растворов кислой РНКазы составляет 50-60, а щелочной РНКаэы 26-30.Затем раствор щелочной РНКазы диалиэуют против 0,01 н. трис-ацетатного буферного раствора с рН,5, При диализе щелочная РНКаза выкристаллиэОвывается. Кристаллы фильтруют и сушат под вакуумом.раствор кислой рнказы диализуют 40 против 0,01 н. трис-НС буферного раствора с рН,0 и сушат лиофильно, как обычно.П р и м е р. 260 л отфильтрованной культуральной жидкости с тем пературой 4-6 С пропускают со скоростью 100 л/ч через колонку (80 х 200 см) с 8 кг анионита ЭЛЭП (СС -форма).Затем раствор подщелачивают до 50 рН,1 и пропускают со скоростью 90 л/ч через колонку (20 х 130 см) с 5 кг анионообменного волокна ЦМ-А 2 (С 3 -Форма). Колонку промывают 100 л дистиллированной воды с той же скоростью, Десорбцию ведут 0,5 н. ИаСС в 0,1 н, ацетатном буферном растворе с рН,0 со скоростью 5 л/ч. Активные элюаты (30 л) концентрируют при рН,0 на ультрафильтре с мембранной УАМпри давлении 2 атм.Получают 500 мл концентрата, который диалиэуют через целлофан против0,01 н. трио-ацетатного буфера срН,5, Раствор наносят на колонку(10 х 50 см) с КМ-целлюлозой, их промывают 0,01 н. трис-ацетатным буфером с рН,5 и элюируют ферменты линейным градиентом ИаС 1 от 0 до 1 н,в 0,01 н. трис-ацетатном буфере срН,5 со скоростью 100 мл/ч. Полученные 1000 мл активных фракций концентрируют ультрафильтрацией, диализуют и наносят на колонку (Зх 100 см)с сефадексом С. Элюцию ведут0,1 н. КСС в 0,05 н. трис-НСГ буфере с рН, 5 со скоростью 60 мл/ч.Получают 200 мл фракции, содержащейкислую РНКаэу и 210 мл фракции, содержащей щелочную РНКазу. Препаратыэлектрофоретически гомогенны и непроявляют ФМЭ-азнрй, ФДЭ-азной иДНК-азной активности. Раствор кислойРНК-аэы диализуют против 0,01 н.трис-НС буфера с рН 7,0 и сушат лиофильно, как обычно,Раствор щелочной РНК-аэы концентрируют ультрафильтрацией до 10 мли диалиэуют против 0,01 н. трис-ацетатного буфера с рН,5. В процесседиалиэа выпадает кристаллическаясоль щелочной РНК-аэы, которую отФильтровывают и сушат в вакуум-сушильном шкафу беэ нагрева, Получают500 мг кристаллического порошка свыходом 26,0 от содержания щелочнойРНК-аэы в культуральной жидкостиВ таблице даны следующие этапыочистки предлагаемым способом:1) осаждение сульфатом аммония,центрифугирование, растворение осадка, центрифугирование;2) диализ, гель - хроматографиина Ср3) ультрафильтрация, диализ, хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе;4) ультрафильтрация, диализ, хроматография на КМ-целлюлозе;известным способом:1) очистка на ЭДЭ, сорбция,десорбция на ЦМ, ультрафильтрация;2) диализ. хроматографии наКМ-целлюлозе;3) ультрафильтрация, диализ,гель-хроматография на 6-75,В таблице приведены данные указанного примера в сравнении очистки кислой рибонуклеазы с литературными данными известного лабораторного метода получения кислой рибонуклеазы,1980 коЗО мула изобретени Составитель М. Ларина едактор Н, Потапова Техред И,Асталош Корректор СШекмаПодписноеомитета СССРоткрытийкая наб., д. 4 Тираж 522НИИПИ ГоСударственногопо делам изобретений035, москва, Ж, Рауш Заказ 2130 ЬО Филиал ППП 1 Патентфф, г, Ужгород, ул. Проектная Применение предлагаемого метода позволяет одновременно получать оба фермента в одном технологическом про цессе, повышенной степени чистоты, значительно упростить технологичес)кую схему и повысить выход кислой РНК-азы до стадии диалиэа и сушки в :реднем на 12 против известного лабораторного способа, Предлагаемый способ позволяет получать большие личества ферментов в промышленных ловиях. 1. Способ выделения рибонуклеазы 35 иэ культуральной жидкости Реп 1 с 11 Ицтп Ьгеч 1 сошрасСшп, предусматривающий хроматографирование культуральной жидкости, ультрафильтрацию полученного элюата и диалиэ, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью одновременного выделения кислой и щелочной рибонуклеаэ, повышения степени их чистоты, упрощения процесса и увеличения выхода ферментов, хроматографирование культуральной жидкости осуществляют в три стадии, на первой иэ которых культуральную жидкость пропускают через последовательно уста-"новленные среднеосновной и высокоосновной аниониты, после чего злюатконцентрируют ультрафильтрацией идиалиэуют, на второй стадии полученный раствор хроматографируют наКм-целлюлозе, концентрируют ультрафильтрацией и диализуют, затем натретьей стадии проводят гель-хроматографию на сефадексе Сс получением двух фракций, одну иэ которых,содержащую кислую рибонуклеазу, диализуют и сушат, а другую - щелочнуюрибонуклеазу - концентрируют ультрафильтрацией и кристаллизуют диалиэом,2, Способ по п, 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве средиеосновного анионита используют смо-.лу ЭДЭП в СГ -форме, а в качествевысокоосновного анионита - анионообменное волокно ЦИ-А 2 в СВ -форме.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Прикладная биохимия и микробиология, 1974, т. 5, вып. 3, с. 432.2, Прикладная биохимия и микробиология. 1972, т. 8, вып. 2, с226