Способ получения противоопухолевого препарата

- т МЬ -М библютОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ 1111520055 Со 1 оз Советских Социалистических Республик,06.76, Бюллетень2 Госуаарственныи комитет Совета Министров СССР(088.8) елам изобретении ытнн ата опубликования описания 27,08.7 б(72) Авторы изобретения Ино абусики Каиша, ХайместранцыЬкамо 1 о и Сабуро Косимурапония)ГП 1 ЫС ФИРМЫКабусики КаишаКогио Кабусики Кайшапония) 1) Заявители И Востр Чугаи Сейяк и Кийова Хакко54) СПОСОБ ПОЛУЧЕ 1.1 ИЯ ПРО 111 ВООПУХОЛЕВП Р Е ПАРА 1 А нь Известен способ получения противооп,холеВого препа 1 зата путем нагреванР 1 Р 1 и;1 е 1 Ок гемолитического с 1 рептококка В те 1 енпс 30 мин 5при 56 С,Однако такой способ не обеспечивает высокой специфической активности препарата,С целью повышения специфической активности по предлагаемому способу клетки предварительно инкубируют с пенициллином в концентрации 2 ОООО-б 0000 едгмл при 30 - 38-Св течение 10- 30 мнн, а потом нагревают при38 50"С.Спосоо Осу 1 цсетвляют следу 1 ОПРим образом. 15Добавляют пенициллин к суспензии клетокгемолитического стрептококка в суспензионной среде до концентрации пенициллина свыше 25000 ед. на 1 мл суопензии, инкуоиР 1 у 1 огсмесь при 30 - 38"С, а затем нагревают при 2038 - 50" С. Продолжительность первой инкубации от 10 до 30 мин, второй - от 20 до60 мин.Используют клетки микроортанизма Ыгср.1 ососснв 11 етпо 1111 снз, выращенного в среде оез 2дополнительной глюкозы. Можно использовать бульон из мясного настоя с содерзканием РНК или РНС от 0,5. до 1,0010 (вес./об).Вместо мясного настоя для получения питады используют ный фосфатом. раньше, т. е. ксреде, или же ионной среде.1 ВО ПЕНИЦИЛЛИзобретение относи Рся к области медици тельной среды использую г другие естественные или полусинтетидеские смеси, однако оез содержания глюкозы, так как Она си.1 ьно сннжасг противоопухолевую активность. Срок выращивания микроорганизмов от 13 до 0 да .После выращивания возникшие клетки микроорганизма - кокки - огделяют центрифу гнРоваНИЕХ 1, ПОЛУДЕННЫЙ ОСВДОК КОККОВ ВЗВС 1 НИВа 1 от В суспеР 1 зионной среде, например, и рас 1- воре со; е 1 ь лучше Всего В основпо 1 среде Ьсрнгеймера. ту среду с рН между о,б и 7,0 но,1 удают путем дооавки мальтозы, монокалинфосфата (КНеРОд) и семиводного ссрнокислого магния (МдЬО(Н,О) к дистиллированной воде.В качестве суспензионной среи солевой раствор, забуферованПенициллин можно дооавитьраисе указанной суспензионноик суспензии кокков в суопензНаиболее эффективное количесна превышает 25000 ед.мл.Полуденную суспензию кокков, содержащую пенициллин, сначала инку оируот 10 - 30 мин при 30 - 38 С, а затем нагревают 20 - 60 мин при 38 - 50 С. Наилучшие результаты получаются, если первая инкубация проводится прп 3 С В течение 20 мин, а последОВательный нагрев - при 45 С В течение 30 мин. Протпво 62005550 55 60 65 опухолевая активность клеток гемолитического стрептококка увеличивается независимо от того, являются ли кокки вирулентными или авирулентными, одновременно вирулентность кокков сильно снижается и способность их к образованию стрептолизина 5 полностью исчезает.Для получения препарата в форме, пригодной для введения его в организм, суспензия кокков после выращивания сообщают асептические свойства, и полученную асептическую суспензию разбавляют до желательной концентр ации. П р и м е р 1. Определение оптимальной концентрации пенициллина в суспензии стрептококков (опыты с лротивораковыми клетками и и 1 го и и чо),Жировые клетки гемолитического стрептококка, выделенные из 100 мл 20-часовой бульонной культуры, промывают два раза физиолотическим раствором (солевой раствор) и взвешивают в 5 мл основной среды Бернгеймера (ОСБ). Полученную суспензию кокков дополнительно разбавляют ОСБ так, чтобы получить суспензии с концентрацией 1/5 и 1/1 О.К 0,5 мл солевого раствора пенициллина (от 2 до 32 Х 104 ед./мл) приливают 2,5 мл суспензии кокков в разбавлении 1:10, Пробирку с этой смесью помещают затем на 20 мин в термостат с температурой 37 С.С другой стороны, подвергают центрифугированию в течение 5 мин при 1500 об/мин молочно-белую асцитичеокую жидкость (30 мл), откаченную из мышей с 8-дневной асцитической карциномой Эрлиха. Отделенные раковые клетки промывают один раз охлажденным солевым раствором, затем охлажденной ОСБ и вновь взвешивают в ОСБ так, чтобы получить концентрацию клеток 60 Х 10 ед./мл.1 мл суспензии раковых клеток приливают к 3 мл суспензии кокков, предварительно обработанной пенициллином, и смесь ставят в термостат с температурой 37 С на 90 мин. Инк бированную суспензионную смесь используют для внутрибрюшинной инокуляции мышам, на каждую мышь берут по 0,5 мл раствора.Животных, которые погиоают в течение опыта, вскрывают для определения причини смерти, животных, которые выживают в течение 50 дней после инокуляции, забивают и вскрывают,Одновременно проводят контрольные опыты с применением смеси из 0,5 мл раствора пенициллина (32 Х 104 ед,/мл), 2,5 мл ОСБ и 1 мл суспензии раковых клеток.Суспензии кокков, предварительно обработанные пенициллином в концентрациях выше 2,7 К 10 ед./мл, очень активны с точки зрения угнетения инвазивности раковых клеток у мышей. При малых концентрациях пенициллина, а именно от 0,7 до 1,ЗХ 104 ед,/мл, только одна мышь из шести не заболевает раком,5 0 5 23 25 30 35 4 Э 45 П р и м е р 2, Длительность лреинкубации гемолитического стрептококка в суспензии в ОСБ, содержащей пенициллин.Концентрация пенициллина поддерживается на уровне 2,7 Х 10 ед./мл, Определяют противораковую активность и в 1 го и и ко в зависимости от длительности времени преинкубации,П р и м е р 3. Противораковая активность 1 и в 1 го у различных препаратов стрептококков в отношении мышей-носителей рака.Живые клетки гемолитического стрептококка из 300 мл 20-часовой бульонной культуры промывают дважды солевым раствором и затем взвешивают в 15 мл ОСБ, Начальную суспензию кокков разбавляют затем ОСБ в отношении 1: 5.1. К 30 мл разбавленной суспензни кокков (1:5) приливают 6 мл раствора пенициллина (16 Х 104 ед,/мл соленого раствора).2, К 30 мл разбавленной суспензии кокков (1: 5) добавляют 6 мл солевого раствора:а) суопензию кокков, содержащую солевой раствор, инкубируют 20 мин при 37 С (А);б) суспензию кокков с солевым раствором инкубируот в течение 20 мин при 37 С и дополнительно нагревают в течение ЗО мин при 45 С (Б).в) суспензию кокков с содержанием пенициллина инкубируют 20 мин при 37 С (В);г) суспензию кокков, содержащую пенициллин, инкубируют 20 мин при 37 С и дополнительно нагревают 30 мин при 45 С (Г).В контрольных опытах мыши-носители раковых клеток получают смесь ОСБ - солевой раствор, ОСБ - раствор пенициллина и 4 суспензии:1) смесь ОСБ с солевым раствором инкубируют 20 мин,при 37 С (а);2) смесь ОСБ с солевым раствором инкубируют 20 мин при 37 С и затем нагревают ЗО мин при 45 С (б);3) смесь ОСБ с пенициллином инкубируют 20 мин прп 37 С (в)4) смесь ОСБ с пенициллином инкубируот 20 мин при 37 С и затем нагревают 30 мин при 45 С (г),Противораковую активность определяют следующим образом.Откаченную молочную асцитическую жидкость мыше с 8-дневной карциномой Эрлиха разбавляют солевым раствором до концентрации 23 Х 10 раковых клеток на 1 мл.Мышей (в каждой группе 6 штук) подвергают внутри брюшни ной инокуляции 0,2 мл суспензии раковых клеток и через 24 час им инъектируют по 0,5 мл испытуемого стрептококкового препарата, эту же дозу вводят дополнительно в течение 4 последующих дней.Из четырех стрептококковых препаратов препарат г, полученный путем натревания суспензии кокков, предварительно обработанной пенициллином, более эффективен, чем все другие,520055 45 50 Малютина Составитель С,Корректор А. Дзесова Редактор Н. Спиридонова Техред Е. Подурушина Заказ 1828/8 Изд. Ме 1553 Тираж 575 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4,5Сапунова, 2 Типография, пр. П р и м е р 4. Опыты по вирулентности различных стрептококковых прспаратов.Приготовляют 4 суспензии кокков в ОСБ так же, как и в примере 3.После этого приготовляют 4 стрептококковых препарата, обработанных различным образом:а) суспензию кокков в ОСБ инкубируют 20 мин при 37 С (препарат Б);б) суспензию в ОСБ с содержанием 2,5;( )(104 ед./мл пенициллина, инкубируют 20 мин при 37 С (препарат П - Б).;в) суспснзию кокков в ОСБ инкубируют 20 мин при 37 С и затем нагревают 30 мин при 45 С (препарат Б - 45);г) суспензию кокков в ОСБ с содержанием пенициллина 2,5 Х 10" ед./мл инкубируют 20 мин при 37 С и затем нагревают 30 мин при 45 С (препарат П - Б - 45). Каждый препарат разбавляют ОСБ и затем вводят мышам внутрибрюшинно. Мыши, которые получили препараты Б, П - Б, и Б в П в в разбавлении 1: 2 млн, погибли, тогда как препарат П - Б - 45 при разбавлении всего 2000 раз не был вирулентным для мьвшей. П р и м е р 5. Влияние пенициллина на способность к образованию стрептолизина 5 суспензией стрептококков (825-образовательная активность).В серию пробирок, в каждую из которых наливают по 3 мл сме:и из 2,5 мл исходной суспензии кокков (в ОСБ) и 0,5 мл раствора пенициллина (24 Х 10" ед./мл); в другую серию пробирок - контрольных - наливают по 3 мл смеси из 2,5 мл исходной суспензии кокков (в ОСБ) и 0,5 мл солевого раствора. Все эти пробирки помещают на 20 мин в термостат с температурой 37 С. Затем по одной пробирке из каждой серии (с содержанием суспензии кокков 4(10" ед./мл пенициллина - из первой серии и суспензии кокков без пенициллина - из второй серии) помещают в водяной термостат с температурой О, 37, 45, 56 или 70 С на 30 мин. Обе смеси, обработанные указанным, путем, подвергают испытанию на ЬХЬ-образовательную активность кокков.Нагревание при 45 С в течение ЗО мин полчостью лишает кокки, взвешенные в ОСБ с 5 10 15 20 25 30 35 40 содержанием 410 ед,/мл пенициллина, способности к образованию стрептолизина 5.П р и м е р 6. К 100 мл бульона мясного настоя с содержанием 1 г пептана и О,5 г хлористого натрия добавляют РНС в таком количестве, чтобы получить 0,8%-ный раствор РНС в питательной среде, Среду стерилизуют, рН,56.Бульонную 20-часовую культуру гемолитического стрептококка (штамм 5 п) пересеивают в эту же среду и инкубируют 20 час при 37 С. Затем бульонную культуру охлаждают, центрифугируют, осажденные кокки дважды промывают солевым раствором и взвешивают в 5 мл ОСБ следующего состава: 675 мл мальтозы, 6 мл 20/о-ного раствора монокалийфосфата, подщелоченного ХаОН (до рН 6,9), 12 мл 2/о-ного раствора семиводного серно- кислого магния и 66 мл дистиллированной воды.Полученную суспензию кокков разбавляют ОСБ так, чтобы образовалась суспензия с десятикратным разбавлением, и к 2,5 мл этой 1)азбавленной суопензии приливают 0,5 мл раствора пенициллина, Для получения этого раствора отдельно растворяют пенициллин 6 как калиевую соль в солевом растворе до концентр ации 16 Х 104 ед./мл, и смесь ин кубируют 20 мин при 37 С и затем нагревают ЗО мин лри 45 С,К полученной кокковой суопензии приливают 1 мл той же суспензии раковых клеток, которую используют в примере 1. Смесь инкубируют 60 мин при 3 С; каждой мыши инъектируют внутрибрюшинно по 0,5 мл смешанной суспензии.ь 1 ерез 50 дней после инокуляции определяют число выживших животных. От рака погибла одна мьпшь, остальные 5 - живы. Их забиванот и вскрывают, признаков опухоли не обнаружено. Формула изобретенияСпособ получения противоопухолевого препарата путем нагревания клеток гемолитического стрептококка, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения специфической активности, клетки предварительно инкубируют с пенициллином в концентрации 25000 - 60000 ед,/мл при температуре 30 - 38 С в течение 10 - 30 мин, а потом нагревают при температуре 38 - 50 С.