Способ определения триглицеридов в веществах

(31) Р 2229849.3 (33) ФРГОпубликовано 28,02.76. Бюллетень8 нтет Министров СССРлам изобретений 088,8)(53) УДК ткрытнй Дата опубликования описания 14.07.7(72) Авторы изобретени Иностранцы Аугуст Вильхельм Валефельд, Ханс Меллеринг, Вольфга Эрик Бернт и Петер Решлау(71) Заявитель фирмаайм ГмбХ Иностранна сБерингер Манн(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИГЛИЦЕРИДО В ВЕЩЕСТВАХС целью упрощения и уменьшения времени определения предложено наряду с липазой к пробе добавлять карбоксилэстеразу и алкилсульфат щелочного или щелочноземельного металла, содержашего в алкильном остатке от 10 до 15 атомов углерода. Алкилсульфат рекомендовано добавлять в количестве от 0,001 до 0,1% (вес/объем), а омыление проводить при рН от 6 до 9, При этом желательно наряду с карбоксилэстеразой и алкилсульфатом в пробу дополнительно вводить альбумин сыворотки в количестве от 0,1 до 2,0 мг/мл. 15 Количествого определениределение пртуре.В качестве20 зовать липазстве карбокссилэстергидропечени млекони свиньи.25 Однако прии другие карточно испольэстеразы на о липазы предпоч у из КЫгорцз а илэстеразы (БСлазу - препара питающих, в ча тительногЫгцз, а 3,1,1.1 )т, получастности исполь в каче карбок емый и из пече менение могут находит оксилэстеразы. Вполн овать приблизительно но определение. ь также е доста мкг Изобретение относится к способам определения триглицеридов в веществах и может быть использовано как при анализе пищевых продуктов, так и в медицинских целях.Известен способ определения триглицеридов в веществах, например пищевых продуктах, предусматривающий их ферментативное омыление путем добавления к пробе липазы и последующее измерение количества образовавшегося глицерина.Недостаток ферментативного расщепления по известному способу состоит в том, что омыление протекает продолжительное время и, кроме того, при осуществлении этого способа необходимо использовать значительные количества дорогого фермента. Для того чтобы реакция протекала в приемлемый промежуток времени, необходимо в одну пробу добавлять около 1 мг фермента. Время реакции превышает 30 мин, поэтому способ мало пригоден для проведения быстрых лабораторных исследований, в частности при частых определениях. Наконец, выделившаяся в свободном состоянии кислота жирного ряда образует с ионами кальция и магния нерастворимые мыла, которые, если не проводить центрифугирование, приводят к помутнению и, следовательно, искажению результатов измерения. липазы, необходимое для одноя, составляет около 20 мкг. Оповодят при комнатной темпераСреди алкилсульфатов желательно использовать соли щелочных металлов, так как они не образуют нерастворимого мыла с выделяющимися жирными кислотами.При добавлении альбумина сыворотки в 5 пробу можно использовать алкилсульфаты щелочноземельных металлов, например додецилсульфат в количестве до 0,001% (вес/объем). Количества более 0,1% приводят к образованию пены и некоторому замедлению реак ции. По этой причине нецелесообразно применять алкилсульфат в таких количествах.Определение можно проводить при рН от 6 до 9. Оптимальная область рН лежит между 7 и 8,5, что позволяет проводить омыление и 15 измерение количества образовавшегося глицерина в одной реакционной смеси.Ионы кобальта и/или магния оказывают активирующее действие на липазу и эстеразу и поэтому могут быть добавлены к реакционной 20 смеси для еще большего ускорения реакции.В качестве буферов могут быть использованы все эффективные в указанной выше области значений рН буферы, кроме фосфатного. Пригодными буферами являются триэта ноламиновый, амидазольный, вероналовый, глициновый, трис-буфер, а также, что менее желательно, амидольный, боратный и коллидиновый.П р и м е р 1, Готовят состоящий из пяти З 0 компонентов реактив, который можно хранить в течение 1 - 2 дней.КомпонентСостав1 0,1 М триэтаноламиновый буфер 85(рН 7,6), содержащий 3 ммоля сернокислого магния, 1,5 мг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота и 0,1 мг/мл додецилсульфата натрия. 4011 Раствор, содержащий 6 ммолейНАДНг, 33 ммоля АТФфф и 11 ммолей фосфоэнолпирувата в дистиллированной воде.111 Суспензия кристаллов, содержащая 2 мг/мл лактатдегидрогеназы и 1 мг/мл пируваткиназы.1 Ч Раствор, содержащий 0,2 мг/мллипазы из КЫкорпз аггЫкцз и 4,0 мг/мл карбоксилэстер азы, 50Ч Суспензия кристаллов, содержащая 2 мг/мл глицеринкиназы,Смешивают 2,9 мл компонента 1, 0,1 мл компонента 11 и 0,02 мл компонента 111, и смесь нагревают до 25 С. Затем добавляют 55 0,1 мл сыворотки, которая содержит триглицериды, подлежащие определению, и полученную смесь выдерживают 5 мин при указанной температуре.После этого к реакционной смеси добавля ют 0,1 мл компонента 1 Ъ, смесь выдерживают 15 - 20 мин при указанной температуре иф Никотинамидадениндинуклеотид в гидрированнойформе.Аденозинтрифосфат, 65сразу же после этого определяют поглощение при 366 им или 340 нм. Найденное значение обозначают Е,. После этого к пробе добавляют 0,02 мл компонента Ч и через 10 мин опять определяют поглощение. Измеренное значение обозначают Е 2, Через 10 мин снова определяют поглощение и полученное значение обозначают Еа.Расчет проводят по уравнению:ЬЕ: (Е, - Ег) - (Ег - Ег). Общее содержание глицерина в триглицеридах (в мг на 100 мл) равно ЬЕ 89,1.Вышеописанное определение повторяют 9 раз, причем каждый раз прибавляемое количество сыворотки уменьшают на 0,01 мл,При нанесении на график полученных значений ЬЕ по отношению к добавленному количеству сыворотки получают прямую линию (см. чертеж),Из найденных значений рассчитывают пропорциональность сг = 0,9986. Сравнение сг (идеальн.) =1000 показывает высокую точность метода.П р и м е р 2. Опыт, описанный в примере 1, повторяют с использованием стандартного раствора триглицеридов.В опыте 1 в реакционную смесь не добавляют карбоксилэстеразу и додецилсульфат, в опыте 2 - додецилсульфат, а в опыте 3 - карбоксилэстеразу.Результаты определения количества триглицеридов представлены в таблице как процентное отношение экспериментально полученных значений к тем концентрациям триглицеридов, которые добавлены в реакционную смесь. Количество триглицеридов по отношению к исходному,%Додецил- сульфат Опыт, % Эстераза 16 24 78 101 Формула изобретения 1. Способ определения триглицеридов в веществах, например пищевых продуктах, предусматривающий их ферментативное омыление путем добавления к пробе липазы и последующее измерение количества образовавшегося глицерина, отличающийся тем, что, с целью упрощения и уменьшения времени определения, наряду с липазой к пробе добавляют Приведенные данные показывают, что при соблюдении выбранных условий в отношении концентрации липазы лишь соответствующая предлагаемому способу комбинация компонентов пригодна для количественного определения,.арпа оставитель Н. Минеева ехред Т. Курилко ктор О. Тюрина иридонов едактор Заказ 1504/16ЦНИИП Изд, ЛЪ 1168 Государственного комитета по делам изобретений и 113035, Москва, Ж, РаушсТираж 1029Совета Министровоткрытийая наб., д. 4/5 ПодписноеССР Типография, пр. Сапунова,5карбоксилэстеразу и алкилсульфат щелочного или щелочпозсмельного металла, содержащего в алкильном остатке от 10 до 15 атомов углерода.2. Спосоо по п. 1, отличающийся тем, что наряду с карбоксилэстеразой и алкилсульфатом в пробу дополнительно вводят альбумин сыворотки. 63. Способ по пп. 1 и 2, отлич а ющий с ятем, что омыление проводят при рН от 6 до 9.4. Способ по пп. 1 - 3, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что алкилсульфат добавляют в количе стве от 0,001 до 0,1% (вес/объем),5. Способ по пп. 1 - 4, о тл и ч а ю щ и й с ятем, что альбумин сыворотки добавляют в количестве от 0,1 до 2,0 мг/мл.