Способ получения одноядерных спор шампиньона

(22) 02.01. 00 Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам(56) М 111 ег К,Е. Ечюдепсе о 1 сехпа 111 у шйе си 1 йча 1 ед пшяЬгоош Адапсиз 1 пзрогцз,Мусо 1 ора, 1971, ъ,63, Х 3, 630-634,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОДНОЯДЕРНЫХ СПОР ШАМПИНЬОНА(57) Использование: биотехнология, грибов одство, пищевая и микробиологическаяпромышленности, при получении одноядерных спор шампиньона. Сущность изобретения: из плодового тела шампиньона настадии зрелого частного покрывала изолируют споры, готовят отпечаток, для чего на(51) б С 12 Я 3/00 1/14 поверхность шляпки без частного покрывала помещают матрасик из ваты и помещают в термостат с температурой 24 С на 24 ч, Затем с полученного отпечатка делают смыв спор водой, Полученную таким образом споровую суспензию наслаивают на охлажденный раствор сахарозы с градиентом 4-х слоев снизу: 65-70, 55-60, 45-50 и 25-30%, раствор центрифугируют при скорости вращения ротора 2900-3000 об/мин при температуре 0-2 С в течение 15-20 мин, отделяют верхнюю фракцию, содержащую одноядерные споры, окрашивают споры по методу Романовского-Гимза, микроскопируют и подсчитывают количество спор, 1 табл.3 18Изобретение относится и способам получения биологического материала и можетбыть применено в растениеводстве (грибоводстве), биотехнологии, пищевой и микробиологической промышленности,Цель изобретения - упрощение способаи повышение выхода одноядерных спор,Цель достигается тем, что берут плодовоетело шампиньона на стадии зрелого частногопокрывала и получают односуточный споровый отпечаток, Использование более старыхплодовых тел недопустимо, так как присозревании спор на базидии ядра митотически делятся и почти все споры становятсямногоядерными, Делают смыв спор водой вколичестве 1-2 мл на один отпечаток.Полученную суспензию наслаивают на раствор сахарозы с градиентом 4-х слоев снизу:65-70, 55-60, 45-50, 25-30 весовых процента,Далее смесь центрифугируют при 2900-3000об/мин при температуре 0-2 С 15-20 мин,затем отделяют верхнюю водную фракцию,содержащую одноядерные споры, и окрашивают ядра в спорах азур-эоз ином послеобесцвечивания пигмента спор в раствореперекиси водорода,Предлагаемый способ является упрощенным, так как не имеет трудоемкой операцииизолирования спор с четырехспоровых базидий при использовании микроманипулятора.Из таблицы видно, что предлагаемыйспособ позволяет увеличить количествоодноядерных спор в исходном материале впять-шесть раз, что позволяет изолироватьна 104 однояде рных спор больше, чем впрототипе.П р и м е р 1, Берут 10 плодовых телшампиньона на стадии зрелого частногопокрывала и обрабатывают каждый грибследующим образом; сухой ватой спихиваютостатки земли; подрезают ножку так, чтобыона выступала за пределы шляпки на 1 см;скальпелем снимают частное покрывало ипомещают плодовое тело на дно чашкиПетри ( диаметр 10 см), На поверхностьшляпки помещают матрасик из ваты, поразмерам превышающий диаметр чашки, инеплотно закрывают чашку Петри крышкой.Чашки помещают в термостате температурой24 С на 24 ч. После чего плодовое тело ивату удаляют и делают смыв спор водой вколичестве 1 мл на один отпечаток, Каждуюспоровую суспензию наслаивают на охлажденный при 4 С раствор сахарозы сградиентом 4-х слоев снизу; 65, 55, 45, 25вес.о. Слои сахарозы наслаивают последовательно снизу вверх по 1 мл автоматическойпипеткой в стеклянные центрифужные пробирки, Растворы центрифугируют при 2900 17472 4 об/мин при 0 С 15 мин на центрифуге "К" с крестообразным ротором, Затем из каждой центрифужной пробирки осторожно отделяют автоматической пипеткой 1 мл верхней водной фракции и переносят в чистую пробирку, В каждую пробу (0,5 мл), содержащую споры, добавляют перекись водорода до конечной концентрации 7,50/ Полученные растворы прогревают при 60 С в течение 10 мин, Дважды отмывают споры центрифугированием (режим тот же) в воде и наносят на предметное стекло тонким слоем. После подсы хани я препарата, его фиксируют в жидкости Карнуа и окрашивают по методу Романовского-Гимза азур-эозином с предварительным гидролизом в 1 н, НС 1. Препараты микроскопируют и подсчитывают споры, содержащие одно и больше ядер. Получают 10 спор о вых суспензий, содержащих в среднем 500 одноядерных спор от общего числа спор в исходной споровой суспензии,П р и м е р 2. Получают 10 односуточных споровых отпечатков (см,пример 1) и делают смыв спор водой в количестве 2 мл на один отпечаток. Каждую споровую суспензию наслаивают на раствор сахарозы с градиентом 4-х слоев снизу; 70, 60, 50, 30 вес,. Растворы центрифугируют при 3000 об/мин при 2 С 20 мин на центрифуге "К", Осторожно отделяют 2 мл верхней водной фракции из каждой пробирки для центрифугирования и переносят в чистые пробирки, Дальнейшие операции аналогичны примеру 1. Получают 10 споровых суспензий, содержащих в среднем 650 одноядерных спор от общего количества спор в исходной споровой суспензии,П р и м е р 3. Получают 10 односуточных споровых отпечатков (см,пример 1 ) и делают смыв спор водой в количестве 0,5 мл на один споровый отпечаток, Каждую споровую суспензию наслаивают на раствор сахарозы с градиентом четырех слоев снизу: 60, 50, 40, 20 вес.о), Растворы центрифугируют при 2000 об/мин при -1 С 10 мин (центрифуга та же), Осторожно отделяют 0,5 мл верхней водной фракции из каждой пробирки для центрифугирования, Дальнейшие операции аналогичны примеру 1, Получают 10 споровых суспензий, содержащих в среднем 10/ одноядерных спор, то есть то же количество, что в исходной суспензии,П р и м е р 4, Получают 10 односуточных споров ых отпечатков (см, пример 1) и делают смыв спор водой в количестве 2,5 мл на один споровый отпечаток, Каждую споровую суспензию наслаивают на раствор5 1817472 6сахарозы с градиентом 4-х слоев снизу: пробирки. Дальнейшие операции аналогичны75,65, 55, 35 вес, Орастворы центрифуги- примеру 1, В полученных 10 споровыхруют при 3500 об/мин при 3 С 25 мин суспензиях споры отсутствуют, так как они(центрифуга та же), Осторожно отделяют 2,5 попали в нижние слои сахарозы.мл верхней водной фракции из каждой ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ писное Заказ 13 пВНИИПИ, Рег. ЛР Мф 040720113834, ГСП, Москва, Раушская наб., 4 1873 Москва, Бережковская наб., 24 стр. 2.Производственное предприятие Патент Способ получения одноядерных спор шампиньона путем изолирования спор из плодового тела, приготовления отпечатка и суспензии спор с отпечатка с последующим микроскопированием, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода спор, изолируют споры на стадии зрелого частного покрывала плодового тела, получают односуточный споровый отпечаток,полученную суспензию центрифугируют в градиенте сахарозы в концентрации (мас. );65-70, 55-60, 45-50 и 25-30 при скорости вращения ротора центрифуги 2900-3000 об/мин, температуре 0-2 С в течение 15-20 мин, затем отделяют верхнюю фракцию, содержащую одноядерные споры, окрашивают их ядра и подсчитывают число одноядерных спор,