Способ получения карбоангидразы

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик о 1195593 О ащ ТЬф(22) Заявлено 06. 0 3, 81 (21) 3257488/28-13 з 11 М. Кл.з с присоединением заявки МА 61 К 35/78 Государствеииый комитет СССР ио делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Н.Г. Доман и Ю.М. Комарова Дщщфщщщщщщ щщ нститут биохимии им. А.Н. Б 71) Заявитель(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОАНГИДРАЗЫ к Изобретение относится к технике производства очищенных ферментных препаратов из растений, в частности к получению карбоангидразы, иможет быть использовано в научных исследованиях различных направленийбиохимии, генетики, а также в медицине для Физиологических исследований.Известен способ получения карбоангидразы путем экстрагирования надземной части растений с последующим фракционированием экстрактасульфатом аммония и гельфитрацией:его на сефадексе. По известному спосо" 15бу высокоочнщенную карбоангидразуполучают из листьев гороха, петрушки, шпината, при этом листья соответствующих растений гомогенизируютв подходящем буфере, гомогенат центрифугирувт при 20000-30000 д-полученный супернатант принимают за исходный экстракт и подвергают фракционному осаждению сульфатом аммония,диализу, затем последовательной 25хроматографии на ДЕАЕ - целлюлозе,ДЕАЕ-сефадексе, гель-фильтрации набиогеле или агарозе или сефадексеультрафильтрации. Причем .метод ультрафильтрации применяется также меж ду отдельными этапами очистки с целью концентрирования ферментного раствора С 13.Недостатками известногО способа являются длительность и многостадий ность процессов, применение дорогостоящих редких импортных реактивовбиогелей, ДЕАЕ-сефадексов, ультрафильтров 3. Выход карбоангидразы невысок и составляет 1-20 по активности и 1 по белку.Целью изобретения является расши-. рение сырьевой базы и повышение выхода целевого продукта.Указанная цель достигается тем, что в способе получения карбоангидразы путем экстрагирования надземной части растений с последующим фра ционированием экстракта сульфатом аммония и гельфильтрацией его на сефадексе в качестве источника сырья иопользуют листья бобов сорта иЧерные русскиеф, экстракцию проводят в трисульфатном буфере и после гель фильтрации целевой продукт элюируют последовательно растворами 20, 40, 60 пМ сульфата натрия в 0,01 М-триссульфатном буфере, далее полученный ферментный раствор концентрируют сульфатом аммония.955930 3 Известный 9,Получение экстракта из листь гороха 3 Фракциониронаннесульфатомаммония Способ осуществляют следующим образом.В качестве исходного сырья используют листья бобов сорта "Черные русские",Растения выращивают в деревянных ящиках с почвой.300 г снежеотобранных листьев (28 дневных ) фиксируют жидким азотом ,и растирают н фарфоровой ступке с 300 мл 0,1 М трисульфатного буФера 10рН 8,0), содержащего 0,1 М,ф-меркаптоэтанола и 0,001 М зтилендиаминотетрауксусной кислоты ( ЭДТА)-буфер А. Растертую массу фильтруют через дноГ,ной слой капрона, Фильтрат цент рифугируют при 22000 д 30 мин, Надосадочную жидкость, содержащую 1400 мг белка, принимают за исходный экстракт.В экстракт добавляют твердый сульФат аммония доконцентрации .40 насыщения. Осадок белков, полученный при этомнасыщении, отделяют центрифугированием при 10000 д 20 мин и отбрасывают. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 55 насыщения. Осадок собирают центрифугированием (10000 д.20 мин) и растворяют в 20 мл буФера А.Полученную фракцию, содержащую 500 мг белка, наносят на стеклянную хроматографическую колонку размером Зх 100 см ) с сефадексом Г, уравновешенную 0,01 Я трис-сульфатным буфером, .содержащим 0,001 М ЭДТА и 0,05 М Р -меркаптоэтанола - буфер В. З 5 После выхода 200 мл пустого объема сбор фракций по 10 мл осуществляют на коллекторе Фракций,со скоростью 1 мл-мин. Во фракциях промеряют белок по поглощению при 280 нм я ак тивность карбоангидразы колориметрическим методом по Вилбур и Андерсон в модифнкации Рикли. Наиболее активные фракции с объемами выхода от 280 мл до, 360 мл объединяют, по лученный объем составляет 80 мл и содержит 250 мг белка.Этот ферментный раствор наслаивают на колонку размером 6.ГАЗО см) с .ДЕАЕ"целлюлозой номинальная 50 емкость 0,60-0,80 мзкв/г, факс;набухаемости 9,0 мл/г сухого ан;.нта, Фирма "Реанал" Венгрия), уравьнешенную буфером Б, содержащим20 мМ сульфата натрия, и неадсорбировавшийся белок вымынают тем же буфером (около 500 мл ), получаяфракцию 1. Затем целлюлозу промывают 300-500 мл раствора 40 мМ сульФата натрия н буфере Б, получая фракцию 11. Проьивание в обоих случаях проводят до полного исчезновения поглощения белка в злюатепри 280 нм; указанных буферных объемов достаточно для достижения этого результата. Затем активную по карбоангидраэе фракцию получают проьынанием ДЕАЕ-целлюлозы раствором 60 мМсульфата натрия в буфере Б, при этомсбор фракций по 10 мл осуществляютна коллекторе фракций со скоростью10 мл/мин. Во фракциях промеряютбулок по поглощению при 280 нм и активность карбоангидразы. Наиболееактивные фракции с объемами выходаот 60 до 180 мп объединяют. Объемполученных фракций составляет120 мл и содержит 112 мг белка. Полученный ферментный раствор концентрируют сульфатом аммония при 70 насыщения, центрифугируют при 22000 д 20 мин и хранят в виде осадка под сульфатом аммония при -20 С. Активность карбоангидраэы сохранялась в течение 6 месяцев..Полученный препарат гомогенен, при исследовании в аналитической центрифуге Яр 1 псо модель Е (США) получается единственный пик с коэффициентом седиментации 15,8 скорость вращения ротора - 48660 об/мин, интервал съемки - 8 мин, концентрация белка 3,5 мг/мл), при аналитическом диск-электрофорезе в 7,5 полиакриламидном геле получается одна полоса.Результаты очистки и выделения карбоангидраэы из листьев бобов ,приведены в таблице, где для сравнения приведены также результаты очистки карбоангидразы из листьев гороха по известному способу.9559 30 Продолжен 1:айлипп 1 3 4 46,2 2,7 Гель-фильтра,9 . 50,2ция на сефадексе Г0,16 200,1 2,1 1847,7 Препаративный диск-электроФорез в полиакриламидном геле Предлагаемый 100 1,0 1400 140 Получениеэкстрактаиз листьевбобовфракционированиесульфатомаммония 35,7 7,8 500 1100 17,9 30,7 Гель-Фильтра 4300ция на сефадексе Г112 22300 159, 3. 8,0 Ионообменная хроматография на ДЕЛЕ-целлю" лозе ФОРьула изобретения 5 ф Способ получения карбоангидразыпутем экстрагирования надземной части растений с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония и гельфильтрацией его на сефадексе, отличающийся тем, что, .с целью расширения сырьевой базы и повышения выхода целевого продукта, в качестве источника сырья используют листья бобов сорта Черные русские, 4 экстракцию проводят в трис-сульфатном буфере и после гельфильтрации целевой продукт элюируют последовательно растворами 20, 40, 60 мИ сульфата натрия в 0,01 М-триссуль фатном буфере, далее полученный ферРезультаты таблицы показывают, что предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет повысить активность гомогенной карбоангидразы в 12 раз и выход (в процентах от общего растворимого белка листьев) в 20 раз.Таким образом, использование предлагаемого способа получения ФерменТа карбоангидразы иэ растений упрощает технологию получения целевого продукта и ускоряет процесс выделения фермента в 4 раза за счет применения ионообменной хроматографии на ДЕЛЕ-целлюлозе вместо препа-. ративного электрофореза, прэволяет . получить высокоочищенный фермент за счет подбора оптимальных условий проведения всех стадий выделения и очистки карбоангидразы, повысить выход и активность гомогенной карбо" ангидразы стабильной при хранении в 20 раз за счет использования в качестве источника сырья листьев бобов. сорта Черные русские" с высоким содержанием фермента (8 от растворимого белка листьев);Отпадает необходимость в покупке препарата карбоангидразы зарубежных Фирм. Отечественный препарат карбоангидразы может найти широкое применениев научных исследованиях по установ лению физиологической роли карбоангидразы в растениях и фотосинтезирующих организмах, а также может полностью заменить препарат животной карбоангидразы, выпускаемой зарубежны. ми фиРмами и применяемый в медицинев физиологических исследованиях.955930 Составитель А. Бражникова.Редактор О. Филиппова Техред С.Мигунова Корректор А. Ференц Заказ 6857/3 Тираж 714ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий,13 3035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Подписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ментный раствор концентрируют сульФатом аммония. Источники инФормации,принятые во внимание при экспертизе1 Асяспа С.А. РЗГегзоп В. П.СгаЬав О. "Р 1 апй сагЬоп 1 с апЬудгазез11. Ргерагаг,1 оп апй Бове ргорег 11 езоЕ Й 1 со 1 уйоп епгуве Сурез". Р 1 апй