Способ выделения рестриктаз ii класса

,СтВ ГОСУДАРСТБЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ТОРСКОМУ СВИД(71) Всесоюзный научно-исследовател ьский институт прикладной энзимологии(56) Цветкова Н.В. Разработка рациональных методов очистки рестрикционных зндонуклеаз. - Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1987, М 7, .с. 77 - 81.Огеепе Р, Неупе 1(ег НЛ Во 11 чаг Р йодг 1 диез Й, А цепега 1 гпейос аког тЬе рцг 1 Н- салоп о 1 гезтг 1 ст оп епупзез - Ицс е 1 с Ас 1( з ВезеагсЬ, 1978, ч,5, М 7, р. 2373-2380. Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу выделения рестриктаз, которые используются для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии.Описаны рациональные методы очистки рестриктаз, Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения рестриктаз, предусматривающий фракционирование бесклеточных экстрактов при помощи фосфоцеллюлозы с последуюшей хроматографией на гидроксиаппатите,Однако этот способ характеризуется низким выходом целевых ферментов: для рестриктаз Аи, Вагп Н 1, Рзт 1, Яа 1 1, Та 91 он составляет 80, 1200, 600, 500 и 160 ед/г биомассы соответственно, что на порядок ниже соответствующих выходов этих ферментов, выделенных во ВНИИ прикладной энзимологии, Выделенные по известному(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу выделения рестриктаз. Рестриктазы используются для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии. Целью изобретения является унификация способа, Способ заключается в том, что выделение рестриктаз проводится по унифицированной схеме очистки: разрушение клеток ультразвуком, функционирование экстракта на гепарин-сефарозе, хроматография на фосфоцеллюлозе и голубой сефарозе. Способ апробирован на примере выделения рестриктаз ХЬа 1, Мои, Есо 1471, А 1 чч 261, Аа 441, Взр 501, Ес 1 13611, Есо 811, Крп 1, Крп 21, Рае 1. 1 табл,Б ВЫ ЕЛЕНИЯ РЕСТРИКТ сщсобу препараты рестриктаз не во всех случаях по своему качеству соответствуют мировым стандартам. Например, для достижения 900 у 0 лигирования после обработки ДНК 50-кратным функциональным , избытком рестриктазы Рзт 1(тест "рестрик. ция - лигирование - рестрикция") обсуждаемую схему очистки (хроматография на фосфоцеллалозе, гидооксиаппатите) необходимо дополнить хроматографией на гепаринсефарозе,Как показывает опыт, в случае ряда рестриктаз нецелесообразно применять фосфоцеллюлозу для фракционирования бесклеточных экстрактов, так как значительная часть активности (или вся активность) рестриктазы оказывается в проскоке, что привсдит к снижению выхода целевого фермента, и как следствие к снижению качества ферментного препарата.Целью изобретения является унификация способа,Согласно предлагаемому способу выделение рестриктаз проводится по унифицированной схеме очистки: разрушениеклеток ультразвуком, фракционирование бесклеточного экстракта на гепаринсефарозе с последующей хроматографией на фосфоцеллюлозе и голубой сефарозе в 0,01 Мкалий-фосфатном буфере, рН 7,4, 0,007 М 2-меркаптоэтанол, 0,001 М ЭДТА с элюциейфермвнта с колонки градиентом йаО 0,10,8 М при хроматографии на гепаринсефарозе и фосфоцеллюлозе и 0,01-0,1 М прихроматографии на голубой сефарозе,П р и м е р 1. Получение рестриктаз ХЬа1, Есо 147 (изошизомер Ятц 1) и йод,Последовательность операций следующая; разрушение клеток, хроматография нагепаринсефарозе, хроматография на фосфоцеллюлозе. хроматография на голубойсефарозе.Для выделения и очистки рестриктазиспользуют следующую аппаратуру; ультразвуковой дезинтегратор УЗДН - 2 Т, центрифугу "Бекман Ж - 21", холодильный шкаф"МиниколдЛаб", хроматографические колонки, термастат, аппарат для электрофореза, универсальный источник питания УИ П.Сорбенты: фосфоцеллюлоза, гепаринсефароза и голубая.сефароза,ДНК фага 1,и плазмиды рСЕЗ выделеныпо известной методике.При разрушении клеток и хроматографии используют 0,01 М калий-фосфатныйбуфер, рН 7,4, содержащий 0,007 М 2-меркаптоэтанол, 0,001 М ЭДТА (буфер А),Активность рестриктаз тестируют мето. дом гидролиэа ДНК фага 1, и плазмидырСЕЗ с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в агарозном геле, Реакционная смесь для гидролиза содержит: 0,01 М трис-НС 1, рН 7,8,0,005 М МдС 12, 0,15 М йаО, 100 мкг/млальбумина(для рестриктаз йат 1 и ХЬа ), 0,01М трис-НС 1, рН 8,0, 0,005 М МдС 12,0,025 МйаО (для рестриктазы Есо 147 1),В реакционную смесь входит ДНК фага А (в случае рестриктаз ХЬа 1 и Есо 147 1)или ДНК плазмиды рСЕЗ рестриктаза йат 1),. Концентрация ДНК составляет 50 мкг/мл, В.пробу объемом 40 мкл вносят 1 - 5 мклсоответствующего ферментного препаратаи реакцию проводят 1 ч при 37 С, Электрафореэ проводят в 0,1 М натрий-боратномбуфере, рН 8,2, 0,002 М ЭДТА в течение 1 чпри напряжении 100 В. Окрашенные этидийбромидом (1 мкг/мл) гели просматривают вУФ-свете, 10 20 зуют в течение 16 ч против 2 л буфера А,30 содержащего 0,1 М йаС 1, ростью 20 мл/ч наносят на колонку (1,5 х 35 40 50 55 За условную единицу активности принимается то количество фермента, которое в оптимальных условиях за 1 ч полностью расщепляет 1 мкг ДРК фаза А,Все операции по выделению и очистке ферментов проводят при +4 С,Для выделения рестриктаз ХЬа 1,йо 11, Есо 147используют биомассы клеток Хапйопопаз Ьабг 1, йосагса оОтЫ 1 зсач 1 агшп и ЕзсЬег 1 сЫа со 11 ВР 147 соответственно,Разрушение клеток: 20 г биомассы клеток суспендируют в 40 мл буфера А, содержащего 0,1 М йаО, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе мощностью 100 Ю в течение 7 мин и центрифугируют при 20000 об/мин на центрифуге "Бекман ЖС", ротор ЖА - 20.Хроматография на гепаринсефарозе, Полученный бесклеточный экстракт со скоростью 20 мл/ч наносят на колонку размером 1,5 х 20 см с гепаринсефарозой, уравновешенной буфером А, содержащим 0,1 М йаО. Колонку промывают 60 мл того же буфера и элюируют линейно повышающейся концентрацией йаС 0,1-0,8 М в 500 мл буфера А, Фракции, содержащие основную часть активности, объединяют и диалиХроматография на фосфоцеллюлозе.Ферментный.раствор после диализа со скох 10 см) с фосфоцеллюлоэой, уравновешенной буфером А, содержащим 0,1 М йаС 1, Колонку промывают 20 мл того же буфера и элюируют линейным градиентом концентрации йаС 0,1-0,8 М в 250.мл буфера А. Фракции, содержащие основную часть рестриктазной активности, объединяют и диализуют в течение 16 ч против 1 л буфера А, содержащего 0,1 М йаС 1,Хроматография на голубой сефарозе, Ферментный раствор после диализа со скоростью 10 мл/ч наносят на колонку (1 х х 10 см) с голубой сефароэой, уравновешенной буфером А. содержащим 0,1 М йаС 1, Колонку промывают 10 мл этого же буфера и элюируют линейным градиентом концентрации йаС 0,1-1,0 М в 100 мл буфера А, Фракции, содержащие основную часть рестриктазной активности, объединяют, добавляют альбумин до концентрации 50 мкгlмл и диализируют против 0,01 М трис-НС 1 буфера, рН 7,4, содержащего 0,05 М КС 1, 0,0001 М ЭДТА, 0,001 М дитиотрейтола и 50 ф( глицерина по ббъему), в случае рестриктаз ХЬа 1 и йод 1, Для рестриктазы Есо 147используют 0,01 М трис-НС 1 буфер, рН 7,4, содержащий 0,1 М КС 1, 0,001 М ЭДРестрикта- за Опыт Микроорганизмы Выход рестриктаэы, тыс.ед,акт,/ 1 кг биомассы Аа 26АЬм 44Взр 50Ес 136 И Есо 81Крп. Крп 2 Рае1 2 3 5 б 8 Аспе 1 оЬасег евой ЯВ 26 АспетоЬас 1 ег ево% ЯВ 44.ВасИцз зресез ЯР:50 ЕпйегоЬассег соасае ЯГ -Л 36 ЕзсЬегсЬа соИ ЯР. 81 К 1 еЬзеИа рпешпопа ОК 8 КеЬзеИа рпешпопа ЯГ 2 Рзеобоеопаз аегц позаВ,В В в 48В - 4501 ВБ - 1823В - 3701 В - 1961 ТА, 0,001 М дитиотрейтол и 50;ь.глицерин (по объему), Ферментные препараты хранят приС,Из 1 г сырой биомассы получают 10000, 200, 30000 ед. активности рес"риктаз ХЬа , йо 1 и Есо 147соответственно.П р и м е р 2, Определение качества ферментных препаратов рестриктаз.Качество рестриктаз определяют двумя тестами: общей оценкой нуклеаз и методом "рестрикция - лигйрование - рестрикция",При проведении общей оценки нуклеаз в пробирки, содержащие по 2 мкг ДНК в 40 мкл стандартной для данной рестриктазы реакционной смеси, вносят различные количества исследуемого препарата и инкубируют 16 ч при 37 С. Продукты реакции анализируют методом электрофореза в 1-ном агарозном геле, При увеличении избытка ферментов до 15-кратного при продолжительности инкубации 16 ч не наблюдается снижения интенсивности и четкости эон в электрофореграмме, что указывает на отсутствие неспецифических нуклеаз в ферментных препаратах.Для оценки качества рестриктаз при помощи метода "рестрикция - лигирование - рестрикция" в пробирки, содержащие 6 мкг ДН К в 40 мкл стандартной для исследуемой рестриктаэы реакционной смеси, добавляют различные количества препарата рестриктазы и инкубируют 16 ч при 37 С. Реакцию останавливают, помещая пробы в 65 С на 10 мин. Состав реакционной смеси коррегируют соответствующими добавками, чтобы его приблизить к оптимальному для лигирования (0,05 М трис-НС буфер, рН 7,6, О, О 1 М М 9 С 2, 0,01 М дитиотрейтол, 0,07мМ АТФ), добавляют ДНК лигазу и инкубируют 16 ч при 120 С.Повторное расщепление проводят ин 5 кубацией при 37 С в течение 1 ч, для чегоиспользуют двухкратный избыток соответствующей рестриктазы. Продукты реакцийрасщепления субстрата, лигирования и повторной рестрикции лигатов анализируют10 методом электрофореза в 1-ном агарозном геле. Лигирование рестриктов и повторное расщепление лигатов происходитполностью и не зависит от избытка рестриктаз в отношении субстрата (до 50- кратного15 функционального избытка).Следовательно, препараты рестриктазХЬа ; Иои Есо 147не содержат примесей неспецифических нуклеаэ и фосфотаз имогут успешно использоваться в работах по20 генной инженерии.П р и м е р 3, Согласно предлагаемомуспособу возможно также выделение другихрестриктазкласса (см. таблицу).Указанные в таблице микроорганизмы25 хранятся во ВНИИ генетика; Всесоюзнойколлекции промышленных микроорганизмов,Формула изобретенияСпособ выделения рестриктазкласса,ЗО включающий гомогенизацию сырья, экстракцию гомогената и хроматографическуюочистку экстракта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, .что, с целью унификации способа, хроматографическую очистку выполняют последова 35 тельно на гепаринсефарозе в градиенте МаС,на фосфоцелллюлозе в градиенте йаС и наголубой сефароэе в градиенте йаС 0,09 - 0,11до 0;98 - 1,02 М.