Рекомбинантная плазмида 5, способ ее конструирования и штамм. 600 5 -продуцент сайт-специфической эндонуклеазы п

СООЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК А 1 И 15/ ЕН ИСА Д,ВЧ ОРСИО вательбиолоГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ(71) Всесоюзный научно-исследо ский институт прикладной микрогии .(53) 575.224.2.577.2(048)(088,8) (56) ОЫрегая Т. В., ОгцЪацф Ь., ЯцЫ 1 тацС Ю, ВоЪег 1 я В. Ю. Тцо печ геяСге 1 оп елйоццс 1 еаяея Ггош Рго 1 еця чц 1 яагЬ. - Бцс 1. АсЫя Вея, 1981, 9, р. 4525-4536.(54) РЕКОИБИНАНТНАЯ.ПЛАЗМИДА рВР 5 ВМ, СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ Е.соН С 600 Р 5 ВМ - ПРОДУЦЕНТ САЙТСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗНДОНУКЛЕАЗЫ Ритц 11. (57) Изобретение позволяет получить эффективный штамм-продуцент эндонуклеазы Ргц 11. Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК рВР 5 ВМ, оп,801294824 ределяющая высокий уровень синтезафермента Рлл 11. Способ ее конструирования состоит в том, что ДНК плазмиды рВВ 322 расщепляют эндонуклеазойЯа 1 1, смешивают с ДНК из РгоСецятц 1 яаг 1 я, гидролизованной эндонуклеазой ХЬо 1, и фрагменты воссоединяютДНК-лигаэой фага Т 4, Полученной смесью трансформируют клетки:Е.со 1.ивысевают на селективную среду с ампициллином. Из полученных клонов выделяют плазмидную Д 1 К, гидролизуютэндонуклеазой Рчц 11 и полученнойсмесью вновь трансформируют клеткиЕ.со 1. Отбирают клоны, устойчивыек ампициллину, из которых выделяютрекомбинантные плазмиды. ШтаммЕ,со 11 С 600 Р 5 ВМ - продуцент сайт -специфической эндонуклеазы Ртгц 11получен трансФормацией плазмидырВР 5 ВМ в штамм Е,со 1 С 600. 3 с.п.ф-лы, 1 табл.Сайты узнавания Расстояние между сай - тами, тыс. пар оснований 0,9 ХЬо 1 - С 1 а 1 2 С 1 а 1 - Нхпй 111 0,2 3 Н 3.пй 111 -НЫй 111 1,8 Н 1 пй 111 -БсоВ 1 ЕсоВ 1 - ХЬо 1 Изобретение относится к областимикробиологической промьппленности имолекулярной биологии и представляетсобой рекомбинантную плазмидную ДНК,определяющую высокоэФФективный синтез сайт-специФической эндонуклеазы,способ ее конструирования и штамм,несущий эту рекомбинантную плазмидную ДНК - продуцент сайт"специфической эндонуклеазы Рчп 11.10Целью изобретения является создание эФФективного штамма - продуцентаэндонуклеазы Рта 11, пригодного длябыстрой очистки Рщ 11.Поставленная цель достигается тем,что сконструирована рекомбинатнаяплазмнда рВРБВМ, онределя 0 щая высокий уровень синтеза Фермента Р"гц 11.Способ конструирования рекомбицатнойплаэмиды основан на гидролизе ДНК изР. чи 1(,агЫ эндонуклеаэой Хйо 1встраивании полученных Фрагментов ввекторную ДНК с последующим клонированием в Есо 1 х и отбором рекомбинантов, содержащих ген эндонуклеазыРTц 11,В качестве штамма - продуцентасайт-специФической эндонуклеазы. СбООРБВМ,Рекамбинантная плазмидная ДНКрВР 5 РМ размером 9000 пар основанийсодержит ген эндонуклбазы,Р.кп 11 исостоит иэ ДНК рВВ 322 в которой поЯа 1 1 - сайту встроен Фрагмент ДНК,полученный нри гидролизе ДНК изР. н 1 дагЫ эндонуклеаэой Хао 1.фрагменг ДНК Р, чщ 1 яагэ имеетразмеры 4700 пар оснований и содержит Огаиты для эндонуклеаз С 1 а 1, ЕсоВ ,и НЫЙ 111 расстояния между которыми приведены в таблице.,Способ осуществляют следующим образом.ДНК-плазмиды рВВ 322 расщепляютэндонуклеазой Яа 1 1, смешивают с ДНКиз Рго 1 ецз гп 1 дьг.з, гидролизованнойэндонуклеазой ХЬо 1, и Фрагменты воссоединяют ДНК-лигазой Фага Т 4. Полученной смесью трансФормируют клетки Е,со 1. и высевают на селективнуюсреду с ампициллином. Иэ полученныхклонов выделяют плазмидную ДНК, гидролизуют эндонуклеазой Ролл 11 и полученной смесью вновь трансФормируютклетки Е.со 1 ь., отбирают клоны, устойчивые к ампициллину, иэ которых выделяют рекомбинантные плаэмидь.Штамм - продуцент сайт-специФической эндонуклеазы Рчц 11, полученныйтрансФормацией плазмиды рВРБВМ вштамм Е.со 1. С 600;.,обеспечивает синтез эндонуклеазы Рщ 11 в количествене менее 100000 ац. на 1 г сырого веса клеток, Ятям (со 3.5. С 600 Р 5 ВМдепонирован во Всесоюзной коллекциипромышленных микроорганизмов приВНИИ "Генетика" под И В 3272.П 1 тамм Е,со 1 С 600 Р 5 ВМ, содержащий плазмиду рВРБВМ, характеризуется следующими признаками.МорФологические признаки: клеткипрямые палочковидной Формь 1 з 2"1,6 х 2,0 х 6,0 мкм, подвжкные, сперитрихальными жгутиками, грамотрицательные,Культуральные признаки: хорошорастут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре колонии гладкие, круглые,.прижаты,блестящие, серые, край ровный, мутные. При росте в жидких средах, мясопептонном бульоне, В-бульоне образуютровную интенсивную муть. Физиолого-бнохюаиеские признаки: растут в пределах 10 - 40 С при оптимуме рН от 68-7,5, В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности глюкозу, Фруктозу, арабинозу, лактозу, галактозу. В качестве источника азота используют минеральные.соли в аммонийной и нитратной Форме, в органической Форме - пептон, аминокислоты, нитраты восста" навливают дс нитритов.1 елатину не разжижают, Уреазная активность не обнаруживается, Индол не образуют.5 Ю 15 20 35 40 45 50 3 2Устойчивость к антибиотикам: проявляют устойчивость к ампициллину,П р и м е р 1. Конструированиерекомбинантной ДНК,При конструировании рекомбинантной плазмиды рВР 5 ВМ в реципиентную плазмиду встраивают фрагмент ДНК Р. гц 1 яагьа. Плазмидную ДНК рВВ 322 выделяют из штамма Е.со 1 ВВТ, содержашего эту плазмиду, 10 г биомассы Е.соН ВВТ суспендировали в 20 мл 20%-ной сахарозы, 2 мМ МяС 1, добавляли 10 мг лизоцима в 1 мл НО, инкубировали при .0 С 5 мин, затем добавляли 0,25 М ЭДТА (рН 8,0) до конечной концентрации 40 мМ, инкубировали 10 мин при 0 С, добавляли 5 М ИаС 1 до концентрации 1 М, 10% тритон Хдо 1% и оставляли на ночь при +4 С; Затем суспеизию центрифугировали при 100000 я 3 ч, к надосадоч ной жидкости добавляли СзС 1 (0,8 г на 1 мл раствора), центрифугировали 30 мин при 5000 об/мин, пленку белков на поверхности жидкости отбрасывали,добавляли бромистый этидий до0,4 мг/мл, после чего раствор центрифугировали 36 ч при 5000 об. минна роторе 50,2 Тх. Зону, соответствующую сверхспиральной ДНК, отбирали, бромистый.этидий экстрагировалиизопропанолом, плазмидную ДНК осаждали этанолом, осадок растворяли в0,5 М ИаС 1 и дополнительно очищалиДНК-хроматографией на колонке с Биогелем А, Фракции, содержащиеДНК, объединяли, ДНК осаждали добавлением 2 объемов этанола, осадок отделяли центрифугированием, растворяли в НО и в таком виде использовалив дальнейшем. ДНК Р. стц 1 яаг 3.з выделяли после лизиса клеток лизоцимом,. как описано вьппе, с последующей фенольной деротеинизацией. После обработки фенолом водную фазу, содержащую ДНК, диализовали против 0,01 Инатрий-цитратного буфера (рН 7,5)инкубировали 5 ч при 25 С 50 мкгпанкреатической РНК-азы, затем вновьобрабатывали равным объемом фенола,последний затем из водной фазы удаляли диализом против 0,01 М натрийцитратного буфера. Полученный препараты ДНК Р, тгц 1 агтв и РВВ 322 испольэовали для получения рекомби- .нантной плазмиды рВР 5 ВМ.ДНК рВВ 322(1 мкг) и Р. чц 1 яагз (3 мкг) гидро 94824 4 лизовали в буфере 100 мМ трис-НС 1 (рН 7,5), 10 мМ 11 С 1, 2 мМ дитиотреит соответственно эндонуклеазы Яа 1 и ХЬо 1 в течение 1 ч при 37 С, затем растворы смешивалн, добавляли АТФ до концентрации 0,07 мкМ и 2 мкл ДНК-лигазы фага Т 4, Объем реакционной смеси 100 мкл, реакцию проводят при 12 С 16 ч, затем 1 ч при 37 С.П,р и м е р 2, Получение штаммапродуцента Рта 11.Для получения штамма-продуцента эндонуклеазы Ргц 11 смесь рекомбинантных молекул ДНК, полученных после обработки ДНК-лигазой, трансформируют в штамм Е.со 1 х С 600, что позволяет использовать его в качестве хозяина, содержащего низкое количество неспецифических нуклеаз, пс сравнению с исходным штаммом Р. гц 1- дага . 50 мл культуры Е,со С 600 подращивают до 2-310 кл/мл, осажМдают при 6000 я 15 мин при ОфС, затем дважды промывают 25 мл 0,1 МСаС 1 и ресуспендируют в 0,5 млтого же раствора. К 12 мл ДНК, полученной после лигазной обработки, добавляют 25 мкл компетентных клеток.Смесь выдерживают 20 мин при ОС, заЗОтем 2 мин при 42 С и 10 мин при 20 пС,переносят в 1 мл среды, индкубируют2 ч при 37"С с аэрацией, Суспензиювысевают в 50 мл среды, содержащей50 мкг/мл амнициллина, выращивают допоздней логарифмической фазы, клеткиосаждают центрифугированием и выделяют из них сверхспиральную ДНК, какописано в примере 1, 5 мкг этой ДНКобрабатывают 1 ч при 37 С 10 ед, эндонуклеазы Рл 11, затем проводяттрансформацию, как описано вьппе, После трансформации клетки инкубируютв 1 мл среды 2 ч и высевают на чашкис 50 мкг/мл ампициллина. Трансформанты отбирают по устойчивости к ампициллину и чувствительности к тетрациклину, Клоны, удовлетворяющие этим условиям, высевают в 5 мл среды, выращивают до поздней логарифмической фазы,клетки собирают центрифугированием итестируют в них содержание эндонуклеазы Ртц ТТ. П р и м е р 3, Тестирование клонов на содержание эндонуклеазы Руц 11 проводили следующим образом. Клетки клона, вырашенные в 5 мл среды, суспендировали в 1 мл 0,01 М калий-фос- фатного буфера (рН 7,0), содержащегости к ампициллину, дает возможностьстабильного культивирования клеток впроцессе получения биомассы,Ф о р м у л а изобретения Составитель Н. КузенковаТехредА.Кравчук Корректор С. Черни Редактор Н. Егорова Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного кощтета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Заказ 562/27 Производственно-полиграФическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 0,1 М ИаСТ, и обрабатывали ультразвуком 3 мин при охлаждении льдом (амплитуда 8 мкм), Обломки клеток осаж.- дали при 40000и в надосадочной жидкости определяли активность 5 Рчи 11. Аликвоты разводили от 1/5 до 1/200 и по 5 мкл из каждого разведения добавляли к 20 мкл реакционной смеси, содержащей 100 мМ трис-НС 1 (рН 7,8), 10 мМ МСТ , 0,5 мкг ДНК Ю фага, инкубировали 30 мин при 37 37"С, Продукты реакции анализировали электрофорезом в геле 0,87. агарозы, гель окрашивали бромистым этидием и Фотографировали при облучении УФ-светом. Фрагментация ДНК указывала на. наличие в клетках культуры эндонуклеазы Ртга 11.Клоны, в которых было обнаружено присутствие эндонуклеазы Ргп 11, вы ращивали в 1 л жидкой среды и определяли в них количество эндонуклеазы Ргя 11 в стандартных условиях (гидрализ 1 мкг ДНК Фага , в 50 мкл за 1 ч).25Штамм Е.со 1 х С 600 Р 5 БМ содержит фермента не менее 100000 ед. на 1 г биомассы. Незначительное количество неспецифических нуклеаэ дает возможность тестировать количество эндонук леазы Рго 11 непосредственно и кле" точном экстракте. Тестирование Рщ 11 в исходном штамме Р. гц 1 дагхь невозможно из-за неспецифических нуклеаз они же затрудняют очистку целево го продукта.Таким образом, предлагаемые объекты позволяют получить штамм Е.со 15 продуцент эндонуклеазы Ртгц 11, Уровень содержания Фермента в предлагаемом штамме не менее 100000 ед, на 1 г сырого веса клеток, отсутствует эндонуклеаза Рки 1, уровень неспециФических эндонуклеаз значительно ниже, чем в исходном штамме, что существенно для получения высокоочищенного препарата фермента, Рекомбинантная плазмида рВР 5 БМ, несущая гель эндонуклеазы Руц 11 и ген реэистентноРекомбинантная плазмида рВР 5 БМ, кодирующая биосинтез сайт - специфической эндонуклеазы Руц 11, имеет размер 9000 пар оснований и состоит из следующих элементов: ЕсоБ 1 - Яа 1 Т - фрагмента плазмиды рВБ 322, расстояния между сайтами 650 пар оснований, ХЪо 1 - ХЬо Т - Фрагмента ДНК Рго 1 еиз уц 1 дагдз, содержащего ген эндонуклеазы Ртгц Т 1.,и сайты СТа 1 Нпй 111, Нхпй 111, ЕсоБ 1, расстоя" ние между которыми (от ХЬо 1 сайта) 900, 200, 1800, 1600 и 150 пар оснований соответственно, Ба 1 1 - ЕсоБ 1 - Фрагмента плазмиды рВБ 322, содержащего репликон плазмиды рВБ 322 и ген,ответственный за синтез бета-лактамазы (определяющий устойчивость к ампициллину).2. Способ конструирования плазмиды рВР 1 БМ, кодирующий биосинтез сайтспецифической эндонуклеазы, заключающийся в том, что ДНК плазмиды рВБ 322 расщепляют эндонуклеазой Яа 1 Т ДНК Ргоецз щ 1- датЫ гидролизуют эндонуклеазой ХЬо 1 полученные Фрагменты соединяют действием ДНК " лигазы этой смесью трансформируют Е.со 3., выделяют из клеток плазмидную ДНК, обрабатывают Рщ ТТ, затем вновь трансформируют клетки Е.соТх. среди трансформантов устойчивых к ампициллину отбирают клоны, обеспечивающие синтез эндонуклеазы Ргц 11, из которых выделяют целевую рекомбинантную плазмиду. У3. Штамм ЕзсЬегс 1 п.а соЫ С 600 Р 5 БМ (коллекция центрального музея промьппленных микроорганизмов института "ВНИИГенетика", коллекционный номер В) - продуцент сайт - специфической энцонуклеазы Ргп 11,