Способ отбора мутантов парафинусваивающих дрожжей

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 8290 119) 111)151)5 С 12 й 15/01 АНИЕ ИЗОБРЕТЕ ВТОРСКОМ ДЕТЕЛЬСТВ собам отбора мутантов микроорганизмов для получения биомассы, Целью изобретения является ускорение селекции дрожжей. обладающих повышенной способностью усваивать короткоцепочечные н-парафины. Суспензию клеток исходного штамма обрабатывают мутагеном и высевают на плотную и жидкую селективные питательные среды, содержащие каприлат натрия в концентрации, полностью подавляющей рост исходного штамма, Выжившие в этих условиях и образовавшиеся отдельные колонии мутантов после очистки рассевом на той же среде проверяют на скорость роста и на уровень наполнения биомассы при культивировании на жидкой парафинсодержащей среде. 1 табл. шии из мутантов, полученных на ищем этапе селекции,Суспензию клеток исходногообрабатывают мутагеном и высеплотную или жидкую селективные иные среды, содержащие каприлатконцентрации, полностью подаврост исходного штамма (применитнашему объекту концентрация селещего агента постепенно повышаласдо С,15;ь). Выжившие в этих услобразовавшие отдельные колониипосле очистки рассевом на той жпроверяют на скорость роста и нанакопления биомассы при культивина жидкой парафинсодержащей срГ 1 р и м е р 1, Суспензию клеток дСапоОа гпатоза ВСБ(лучшегостных прол 1 ышленных прпдуцентоного белка на основе н-пара редыдупоГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(71) Институт микробиологии АН БССР(56) Исследование возможности получения .п.1 рафинусваивающих дрожжей, отличающихся большей продуктивностью на легкихфракциях н-парафинов (Отчет о НИР)/ВНИИсинтеэ белок. - М ГР 01829047329, М.,1984, с, 10.(54) СПОСОБ ОТБОРА МУТАНТОВ ПАРАФИНУСВАИВАЮЩИХ ДРОЖЖЕЙ(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к споИзобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам отбора мутантов микроорганизмов для получения биомассы.Целью изобретения является ускорение селекции дрожжей, обладающих повышенной способностьо усваивать короткоце чечные н-парафины.Отбор мутантов проводят как на плотных, так и на жидких питательных средах, содержащих селектирующий агент, каприлат натрия, Концентрацию подбирают таким образом, чтобы основная масса клеток исходного штамма не способна была образовывать колонии, Этой способностью обладают лишь немногие мутантные клетки дрожжей, приобретшие ее в результате действия мутагена, На каждом этапе селекции . концентрацию каприлата натрия увеличивают, а мутагенной обработке подвергают лучштамма вают на итательнатрия в ляющей ельно к ктируюь от 0,02 овиях и мутанты е среде уровень ровании еде, рожжей из извев корл 1 офинов)ъыра 1 ц 1 лваю 1 в спГциальных каЗлочныхколбах емкостькэ 500 мл на высокоскоростной качалке 240 об/мин) при 33 С в жидкой.1 ита,ельной среде Г 1 О 50 1 л Следующегоэостава, мас.%Паэафинь 1 Н 1 эвополОЦкОГОПЗ 0,4 (С 9 следы, С 1 о 2,5; С.э,б; С 12 13,8,С ц 18С, 19,5; С 1; 16,6; .С 1 о 0.7; С 7 7,4:С 18 2,0; С 19 0,2; К 2 РО 4 3 Н 2 о 0,38, ВН 2 РОлк12 Н 20 0,35; Мс)С 2 О,1; (Г.л)2 эГ 34 0,422, водопроводная вода - Остальное, рН 5,0-5,5,Полученную суспензию обрабатываютхимическим мутагеном нигризогуанидиномКОнЦентраЦией 11 мГ/мл 1560 мин. Затемотмывают мутаген фосфя 1 ным б фером, рН7,0,Суспензию микроорганизмов высеваюгпо О,". мл на чашки Попэи с питательнойсредой, имеющей сду,-.;.,кй составмас,%: этилОВыЙ с 11 ир 1 0,4,:1 инеральныекомпоненты, как В сос 1 аво с,еды, поиьеденном Выше, каприлат натрия 0,01-0,03; водочроводная вода - остальное.Настадии селекции используют водорастворимый источник углерода этанол, такКак пути его ассимиляции бл 1 лзки с таковыии алканов. Исходный штамм ВСЬ Очень чувствителен к каприлату натрия, да.;ке концентрация 200 мг/л полностью подавляет е 1.о рост. Ус 1 ойчивые; этойконцентрации мутанты образовывали види 1ые колонии только чг 1 эез 7 сут. Более вь:,.окие концентрац 1.л 1033 ) настолькоподавляют рост, чпго даже Отдельных коло ГИЙ на сред,":; не Возникало, Меь 1 ьшие кгнцентрации (0.,01 %) не облада 1 Оселетирующим действием - на чашках в -,:.эостал сплОшнОЙ Га "Он.Устойчивь е к каприлату на 1 р я колонииотсева 1 от и очища от расссвом разведен нь 1 хсуспензий на среде того жо со 1 п авгьОчищеннье колонии каприлатустойчивых мутантов г 1 роверякэт на продуктивностькак по биомассе .:. Скорос 1 И роста, так иисходным материалом для дальнейшей сеГ 1 екции на овышене стег 1 ен 1 л усэоичивости к каприлату на 1 рия.ПэОВеэку каГ 1 рилатусГойя ивых мугантОВ 11 а продукти Вность Г 10 био 1 лассе и Определение удельных скорое, ей росапроводяг на среда где минеральные компоненты бь ли, как В примере 1, а источником углерода б,: ли, одном случаепарафинь 1 В количес 1 ве 0,4 лас,% (достаточном для измерения), а в др,гам - смесьпарафинов с октаном и додеканом (2 11;1) -0 4 мвс.%,Результа гы исследования продукгивно"с 1 и мутанто:1 В сэа Внен 1 и Г. Нсходнь 1 м ш таммом нас Вд 1 л 1 л со;1 сц 11 по".ПВ 1 Ва 1 от, чтомутанты Вврьиэуэ 1 пс В,хо,:,у био"1 ассы от 90 до 115% от исходного штамма. причемповышенной продуктивностью обладаютоколо 45% проверенных вариантов,этап - селекция на устойчивость ;5 возрастающим концентрациям каприлатанатрия, Ее осуществляют двумя путями, Параллельно с селекцией на плотных селективных средах с концентрациямикаприлата натрия 0,05 и 0,08/) проводят10 автоселекцию дрожжей (с концентрациейкаприлата натрия 0,1 длительным культивированием их(в течение 2 мес) в глубинныхусловиях - в колбах на качалке (условиякультивирования в колбах описывались вы 5 ше),Селекция на средах со все возрастающими концентрациями каприлата натрияг;реследует следующие цели, На первом ееэтапе, где кэприлат натрия с концентрацией20 0,02% используют В качестве селектиоующего фактора, отбирают формы, имеющиеустойчивость к каприловой кислоте, На следующем этапе селекции, где единственнымисточником углерода в среде служит капри 25 лат натрия, возникают мутанты, способныерасти на повышенной концентрации этоговещества.По-видимому, автоселекция на среде саприлатом натрия как единственным ис 30 1 очн иком углерода приводит к отбору формс повышенной активность 1 о ацил-КОА-синтетазы, На каждой ступени повышения ус.1 ойчивости дрожжей к каг 1 рилату натриявозникают мутации различных генов, в Ое 3." зультатс чего отбирают формы с активациейнескольких ферментативных стадий процесса ассимиляции алканов,П р и м е р 2, Селекцию каприлатустойчивых мутантов на повышение степени ус 20, ойчивости к возрастающим дозамкаприлата натрия 0;05 и 0,08 % проводят какв примере 1, Минеральные компоненты среды были такими же, как и в среде примера1, а в качестве единственного источника уг 45 лерода служил каприлат натрия, соответстВенно 0,05 и 0,08%. Все процедурыьыполняют так, как описано в примере 1,П р и м е р 3, Автоселекцию каприлатугтойчивых мутантов, отобранных в примере50 1, осуществляют дл 1 лтельным культивированием их в глубинных условиях в колбах накачалке 1 условия культиВирования ОписаныВ примере 1). Все минеральные компонентьсреды как в примере 1, а каприлат натрия в55 количестве 0,1 % служит единственным ис 1 очником углерода, Все жизнеспособные вселективных условиях мутанты после очистки проверяют на продуктивность. К,эоме того продолжают селекцию на устойчивость ке 1 де большим кон Центэаци Ям кап эила 1 а натрия тех мутантных формкоторые были выделены в результате эвтоселекции,П р и м е р 4. Селекцию на повышение степени устойчивости к каприлату натрия в концентрациях 0,12; 0,15; 0,18 и 0,20 О(, про водят как в примере 1, первые два режима селекции (0,12 и 0,15 о( каприлатэ натрия) дают множест во мутантов. На среде с 0.18;, образуется несколько колоний, однако после пересева жизнеспособных форм не бы ло выделено, На максимальной из использованных концентраций каприлата натрия не обнаруживают ни одной колонии спустя 3 недели культивирования.В таблице показаны основные характе ристики исходной культуры и выделенных мутантов. Как видно из таблицы, некоторые выла. ленные мутанты, проведшие селекцию в несколько этапов, на 32 продуктивнее. чек исходная культура и их предшественники,Сравнение способности по накоплению биомассы и удельных скоростей ростав периодическом культивировании на качалке исходного штамма дрожжейСапд 1 да ша 1 сода ВСБи мутантов, полученных селекцией на каприлатенатрия разными способами Опыт Штамм дрожжей Культивирование на средах с 4 г/л н-параФинов за 72 ч параФины (С,о -С ) Те же параФины с октачоми додеканом (2:1:1) ь мутантов, превосхо" дяцих исходный штамм Биомасса, гл Удельнаяскорость мутантов превосходяи 1 их исходный штамм Биомасса,гул Урельная скорость,45,0 006 192+010 700 0,05 1,40-001селекцией на плотных средах (в скобках указана концентрация каприлата 202 фо 63 1,89+0,20 214 О 09 1 99+0,12 о,о 6 0,06 0,07 0,06 1,54+0,111,51+0,16 157+0,06 1,85+0,35 0,06 С,об 0,06 0,07 натрия (0,1 т;) среде с каприлатом22610461,91+ 0,262,54+ 0,582,460,58 автоселекцией на жидкой 154+0,15 1,57+0,02 О,98+О,53 1,45+0,10 0,06 0,06 0,03 0,05 0,07 006 0,09 0,09 Составитель Н.КузенковаТехред М.Моргентал Корректор Н,Ревская Редактор Т.Лазаренко Заказ 4368 Тираж Подписное ВНИИПИ Госудаоственного комитета по изобретениям и открытиям пои ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушскэя нэб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагэоина, 101 1 Исходный штаммСапдЫа ша 1 СозаВСБ Мутанты, полученныенатрия в среде)2 31 (0,053)3 65 (0 12)75 (0 123)5 92 (О, 153)Мутанты, полученные6 447 468 549 56 Формула изобретения Способ отбора мутантов парафинусваивающих дрожжей, включающий обработку культуры мутэгеном, рассев и выращивание на питательной среде с селектирующим агентом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения селекции дрожжей, обладающих повышенной способностью усваивать хороткоцепочечные н-парафины, в качестве селектирующего агента используют каприлат натрия.