Способ получения фосфолипидного носителя холестерина

(19) 0 Рс ч,г 1 1 4ЦТЦ 1 Л- Т-В 4 с"Ф, с 1 ПИСАН ЕТ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПИДНОГО НОСИТЕЛЯ ХОЛЕСТЕРИНА(57) Изобретение относится к медицине, аименно к биохимии, и касается способа пол Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и касается способа получения фосфолипидного носителя холестерина.Целью изобретения является повышение специфической активности.Способ осуществляется следующим образом,В качестве липидной дисперсии используют смесь высоконенасыщенного фосфолипида и холестерина в молярном соотношении 1:2, дополнительно содержащую вещество, придающее отрицательный заряд, обрабатывают ультразвуком мощностью 280 - 300 Вт в течение 9/10 мин при 0 - 4 С и фильтруют через ядерный фильтр диаметром пор 0,2 мкм.П р и м е р 1. К 1 мл хлороформного раствора(100 мг/мл) хроматографически чистого лецитина из соевых бобов (фирма йаттегаапп, ФРГ) добавляют 1 мл хлороформного раствора холестерина (100 мг/мл) и 125 мкл раствора дицетилфосфата(юц 5 А 61 К 37/22, 31/68 учения фосфолипидного носителя холестерина. Целью изобретения является повышение специфической активности, Способ осуществляется путем обработки липидной дисперсии, представляющей смесь лецитина иэ соевых бобов и холестерина при молярном соотношении 1:2, дополнительно содержащую дицетилфосфат или фосфатидилсерин, или фосфатидную кислоту, или жирную кислоту. содержащую Си, или С 14, или С 16, или С 1 в, ультразвуком при охлаждении, центрифугирования и последующей фильтрации через ядерный фильтр диаметром 0,2 мм. 1 табл. У) (25 мг/мл) в смеси хлороформ - метанол 2:1 по объему, Смесь высушивают на роторном испарителе в течение 40 мин. В колбу добавляют 20,4 мл забуференного физиологического раствора, рН 7,4,Смесь инкубируют в встряхивающем ф термостате в течение 1 ч при 37 С, Далее О смесь обрабатывают ультразвуком на дис- . о пергаторе "Соник" (Р 1 зЬег, США) мощ- С) ностью 300 Вт в течение 10 мин при сохлаждении (температура охлаждения С), температура в пробе не выше 4 С), Пробу центрифугируют на центрифуге КО (1 апеЫс 1, ГДР) для осаждения многослойных липосом и частиц титана. Полученную суспензию продавливают через ядерный фильтр (диаметр фильтра 47 мм) с порами 0,2 мкм (КцсИеороге, США). Полученный фосфолипидный носитель холестерина (ФНХ) анализировали на холестерин и фосфолипиды на биохимическом анализаторе "Центрифихем" (Ва 1 ег, США). Для измерения холестерина использовали набор ре 169076920 получается целевой продукт в виде стериального ФНХ с молярным отношением хо 35 Физико-химические свойства липосом, 40полученных по описанному способу, прове 45 50 активов. Монотест Холестерол (ВоеМг пдег, Австрия). Состав реактива. трис 100 мМ, рН 7,7; магний аспартат 50 мМ, 4-аминофенаэон 1 мМ, натрий халат 10 мМ, фенол 6 мМ, 3,4-дихкорфенол 4 мМ, холестеринэстераза 0,4 ед/мл, холестериноксидаэа 0,25 ед/мл, пероксидаза 0,2 ед/мл. Анализ проводился путем смешивания 5 мкм пробы и 350 мкл реактива, инкубировали при 37 С в течение 5 мин и фотометрии при 510 нм. В качестве стандарта использовали стандартный раствор холестерина (200 мг/100 мл) (ВоеКг 3 пдег, Австрия), Для измерения фосфолипидов использовали набор реактивов Комбинированный Тест фосфолипиды (ВоеЫпдег, Австрия). Состав реактива: трис 50 мМ, рН 8,0, фенол 20 мМ, фосфолипаза Д 1,0 ед/мл, холиноксидэза 1,4 ед/мл, пероксидаза 0,8 ед/мл, 4-аминофеназон 8 мМ. Анализ проводили путем смешивания 10 мкл пробы с 350 мкл реактива, инкубировали при 37 С в течение 10 мин и фотометрии при 510 нм, В качестве стандарта использовали прилагаемый к набору стандартный раствор холинхлорида (54,1 мг/100 мл) Анализы холестерина и фосфолипидов а полученном ФНХ дали следующие результаты: холестерин 361 мг/100 мл, фосфолипиды 424 мг/100 мл. В результате лестерин/фосфолипиды 1,7, учитывая, что средний молекулярный аес фосфолипидов в 2 раза больше холестерина. При повторении описанного способа получается целевой продукт с содержанием холестерина 340-370 мг/100 мл и фосфолипидов 407- 440 мг/100 мл, что дает колебания отношения холестерин/фосфолипиды от 1,5 до 1,8. рялись с помощью стандартного метода преципитации (ЛПНП) и флотации в сыворотке крови при центрифугировании.Проверка активности препарата.К 1 мл сыворотки крови добавляли 0,4 мл ФНХ, полученного по предлагаемому способу или по известному способу, инкубировали при 37 С в течение 1 ч. Преципитацию проб проводили путем добавления раствора фосфоаольфрамовой кислоты (0,55 мМ) и хлористого магния (25 мМ) в соотношении проба:преципитант 1:2 по объему, Смесь стояла при комнатной температуре и затем центрифугироаалась 10 мин при 4000 д, При ЛПНП преципитируют иудаляются вместе с осадком, в супернатанте и остаются только ЛПВП. Супернатант отделяли и анализировали вместе с пробой исходной сыворотки на холестерин и 5 10 15 фосфолипиды, как описано а примере 1. Результаты приведены в таблице,Из данных, приведенных в таблице,видно, что ФНХ, полученный по предлагаемому способу., имеет более высокий холестерин (фосфолипидный индекс 1,67), чемФНХ, полученный по известному способу(0,99) и практически полностью преципитирует вместе с ЛПНП в отличие от прототипа,что подтверждает взаимодействие ФНХ сЛПНП.Сыворотку крови смешивали с ФНХ иинкубировали как описано, в микропробирку наливали пробу и центрифугировали наультрацентрифуге с воздушным приводом(Аэрофуга, ВеЬпап. Австрия) с ротором А 100 в течение 2,5 ч при 3000009. С помощьюручного фракционатора азрофуги содержимое пробы фракционировали по вертикалина 11 фракций и а каждой фракции определяли концентрацию холестерина, как описано в примере 1, Для каждой фракцииполучали свое значение концентрации холестерина, Аналогичные процедуры проводили и с контрольной пробой, где к сывороткекрови вместо ФНХ добавляли физиологический раствор. Для каждой фракции из значений холестерина, полученных в опытнойпробе, вычитали значения холестерина,полученные в контрольной пробе.В результате проведенных исследований выявлено, что ФНХ, полученный такимобразом, флотирует в области ЛПНП, в товремя как ФНХ, полученный по известномуспособу, гетерогенен по удельной плоскости и флотирует как в области ЛПНП, так иа области липопротеидов высокой плотности.П р и м е р 2. Способ осуществляетсяаналогично примеру 1, эа исключением того, что вместо дицетилфосфата используется фосфатидилсерин в тех жесоотношениях. В результате был полученцелевой продукт с концентрацией 8,2 мг липида/мл, Полученный продукт не уступалпродукту, полученному по примеру 1.П р и м е р 3. Способ осуществляетсяаналогично примеру 1, за исключением того, что вместо дицетилфосфата используютфосфатидную кислоту а тех же соотношени-ях. В результате был получен целевой продукт в концентрации 8,5 мг липида/мл, неуступающий по своим свойствам продукту,полученному по примеру 1.П р и м е р ы 4.5,6,7.Способы осуществляются аналогичнопримеру 1, за исключением того, что вместодицетилфосфата используют жирную кислоту С 1 г, или С 14, или Сы, или С 1 в в тех жесоотношениях, а результате были получены,Осауленко каэ 3876 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 ательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10 одстее продукты с концентрацией соответственно 8,0,8,0,8,3 и 8,5 мг липида/мл, не уступающие по своим свойствам продукту, полученному по примеру 1,Предлагаемый фосфолипидный носи тель холестерина позволяет повысить холестерин/фосфолипидный индекс с 0,99 до .1,67, а также практически полностью взаимодействует с липопротеидом низкой плотности в отличие от известного, который 10 такой специфичностью не обладает.Формула изобретенияСпособ получения фосфолипидного носителя холестерина, включающий обработ 15 ку липидной дисперсии ультразвуком при охлаждении и центрифугировании, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения специфической активности и взаимодействия с липопротеидом жидкой плотности в качестве липидной дисперсии используют смесь лецитина из соевых бобов и холестерина при молярном соотношении 1:2, дополнительно содержащую дицетилфосфат или фосфатидилсерин, или фосфотидную кислоту, или жирную кислоту, содержащую С 12, или С 14, или Сы, или С 1 в, и затем фильтруют через ядерный фильтр диаметром 0,2 мкм,