Способ определения антистафилококковой активности препарата

(51)5 С 12 0 1/04 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ ДЕТЕЛ ЬСТВ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(21) 4403035/2 (22) 04,04.88 (46) 15.06.90, (71) Оренбург цинский инсти (72) В.Ю.Соко С,И.Мамотенк (53) 576.8.093. (56) Авторское М 1097675, кл (54) СПОСОБ Ф ИЛОКОККО РАТА (57) Изо именно Бюл. М 22ский государственный меди-. тут лов, О.Л.Чернова, А,П,Луда,о, О.В,Бухарин и Б.Я.Усвяцов1 (088,8) свидетельство СССР, С 12 0 1/04, 1984. ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИСТАВОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАбретение относится к медицине, а к микробиологии, Цель изобретения Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии.Целью изобретения является ускорение способа.Способ осуществляется следующим образом.В опытные пробирки добавляют исследуемые препараты в концентрации 1/10 от МБК, заливают 1,5 мясопептонным агаром. Контрольные пробирки готовят без добавления препарата. Засевают исследуемые штаммы, инкубируют 18-24 ч. Затем из выросших штаммов готовят опытные и контрольные микробные взвеси (все разведения выполняются на фосфатном буфере рН 6,2). Взвеси стандартизуют фотонефелометрическим методом по оптической плотности, которая при синем светофильтре и кювете шириной 5 мм равна 0,3. Параллельно готовят разведения лизоцима концентрацией 20-10-8-6-4-2 мкг/мл, Затем к 1 мл Ж 1571069 А 1- ускорение способа. Определяют чувствительность методом серийных разведений, например к фурацилину и витамину А. Засевают три пробирки исследуемым штаммом, добавив в первые две пробирки соответственно фурациллин и витамин А, третья пробирка - контроль. Инкубируют 24 ч при 37 С и стандартизируют взвеси стафилококков, для чего добавляют раствор лизоцима концентрацией 20 мкг/мл. Определяют количество сорбированного лиэоцима как разницу между рабочей концентрацией лизоцима и остаточным лизоцимом. Использование изобретения позволит ускорить срок отбора препарата, 1 табл. стандартизованным опытным и контрольным взвесями стафилококков приливают 1 мл раствора лизоцима 20 мкг/мл и инкубируют 10 мин при 37 С, Затем центрифугируют 25 мин при 3000 об/мин, надосадки отсасывают в количестве 0,6 мл и определяют остаточный лизоцим нефелометрическим методом. Для определения остаточного лизоцима готовят взвесь микрококка оптической плотностью Д,2, Разливают в три ряда пробирок по 2 мл и добавляют 0,6 мл надосадка из опытных и контрольных пробирок и калибровочного раствора лизоцима 10-8-6-4-2 мкг/мл, инкубируют 10 мин при 37 С, затем замеряют оптическую плотность взвеси микрококка при синем светофильтре в кювете шириной 5 мм. По калибровочной кривой находят количество остаточного лизоцима в надосадочной жидкости. Величинусорбированного лизоцима определяют как разницу между рабочей10 15 20 30 35 40 45 50 55 концентрацией лизоцима (10 мкг/мл) и остаточным лиэоцимом, Отбор препарата проводят по степени увеличения сорбции лизоцима стафилококками из среды с суббактериостатической концентрацией препарата по сравнению с контролем.П р и м е р 1, У бактерионосителя Н 24 года, из клеток слущенного эпителия слизистой носа выделен золотистый стафилококк,Методом серийных разведений определяют его чувствительность к препаратам фурацилину и витамину А-МБК. Готовят три пробирки с агаровой средой. В первую и вторую добавляют соответственно 1/10 МБК фурацилина и витамина А - опытная партия, а в третью - контрольную пробирку препарат не добавляют.Все пробирки засевают исследуемым штаммом и после 24 ч инкубации при 37 С готовят и стандартизируют взвеси стафилококков из опытных и контрольных пробирок по описанной методике. Для этого к 1 мл взвеси в каждой пробирке добавляют 1 мл раствора лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл, инкубируют 10 мин при 37 С, получают надосадки в количестве 0,6 мл и определяют в них количество остаточного (несорбированного стафилококками) лизоцима. Для этого приготовленную взвесь тест-культуры микрококка оптической плотностью Д=1,2 разливают по 2 мл в три ряда пробирок и добавляют по 0,6 мл полученных надосадков иэ опыта и контроля, 0,6 мл калибровочного раствора лизоцима 10-8-6-4-2 мкг/мл, инкубируют 10 мин при 37 С. В контроле определяют оптическую плотность 0,32, по калибровочной кривой определяют, что это соответствует концентрации лизоцима 7 мкг/мл. Рабочая концентрация лизоцима 10 мкг/мл, следовательно, количество сорбированного лизоцима по поверхности стафилококков в контроле 10- 7=3 мкг/мл.В опыте с витамином А оптическая плотность микрококка после инкубации с надосадком 0,46 по калибровочной кривой, Это соответствует концентрации лизоцима в надосадке 4 мкг/мл, Количество сорбированного лизоцима на стафилококках 10-4=6 мкг/мл, В опыте фурацилином оптическая плотность микрококка после инкубации с надосадком 0,37, что соответствует концентрации лизоцима 6,5 мкг/мл, Количество сорбированного лиэоцима на стафилококках в опыте с фурацилином 10-6,5 мкг/мл=3,5 мкг/мл.Увеличение сорбции лизоцима стафилококками в опыте с витамином А 100% (с 3 мкг/мл до 6 мкг/мл), а в случае с фурацилином 17% (с 3 мкг/мл до 3,5 мкг/мл), что позволяет оценить витамин А как более эффективный препарат для санации стафилококковых бактерионосителей,П р и м е р 2. У бактерионосителя Д. 22 лет из клеток слущенного эпителия носа выделен золотистый стафилококк, проверка действия хлорофиллипта и риванола предлагаемым способом показала, что концентрация сорбированного на стафилококках лизоцима предлагаемым способом в контроле 4 мкг/мл, в опыте с хлорофиллиптом 7 мкг/мл, в опыте с риванолом 5 мкг/мл. Увеличение сорбции лизоцима в опыте с хлорофиллиптом 75%, а в опыте с риванолом 25% (по сравнению с контролем). Это позволяет оценить хлорофиллипт как более эффективный препарат для санации стафилококковых бактерионосителей,Проведена санация 200 стафилококковых бактерионосителей с использованием фурацилина и витамина А. Все бактерионосители разделены на 2 группы по 100 человек в каждой. Санация препаратами проводилась один раз в день в течение 6 сут путем смазывания слизистой носа масляным раствором 3,44% витамина А, в концентрации 6 тыс, м,е, и фурацилином в разведении 1:5000.Оценка влияния препаратов на антилизоцимную активность(чашечный метод) и на сорбцию лизоцима (ФЭК-метод) стафилококками приведена в таблице.Из таблицы видно, что наименее выраженным действием обладают фурацилин и риванол: антилизоцимная активность снижается на 5 и 4% по прототипу, а сорбционная активность соответственно в незначительной степени повышается на 20 и на 10%.Наиболее выраженным действием обладают облепиховое масло и витамин А, Антилизоцимная активность снижается на 22 и 27%, повышается сорбционная активность на 110 и 101%.Использование изобретения позволит в течение 6-7 ч отобрать наиболее эффективный препарат для санации стафилококковых бактерионосителей,Формула изобретения Способ определения антистафилококковой активности препарата путем инкубирования стафилококка в питательной среде в присутствии исследуемого препарата с последующей оценкой активности препарата по изменению содержания лизоцима, отличающийся тем,что,сцельюускорения способа, после,инкубирования микроорганизм отделяют от питательной среды, суспендируют, затем к суспенэии добавляют1571069 Составитель Е,ЯрныхТехред М.Моргентал Корректор Н.Ревска Редактор О.Спесивы аказ 1487 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10 лизоцим и нефелометрическим методом по количеству лизоцима, осевшего на микробную клетку, оценивают активность препарата.