Способ идентификации лектинов

10 15 алами реплики, например с нитроцеллюлозой. Молекулы лектинов, фиксированные на поверхности реплики, способны соединяться с углеводными остатками мембран эритроцитов своими свободными реакционными центрами. Фиксация лектинов на реплике позволяет им достаточно прочно удерживать эритроциты, что, например, дает воэможность даже прополаскивать реплику в физиологическом растворе для уменьшения фона от неспецифичности осевших зритроцитов. При отсутствии такой фиксации механически стабильных спектров агглютинировавших эритроцитов получить практически невозможно или по крайней мере очень трудно,П р и м е р 1, Идентификация компонентов агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) в спектрах белков зародышей после изофокусирования.Зародыши отделяют от зерна пшеницы сорта Безостая 1. Навеску из 100 мг зародышей, размолотых в ступке, заливают 1 мл 0,1 НС, Смесь центрифугируют, осадок отбрасывают.Для выбора оптимального для определяемого лектина состава реплики готовят несколько типов реплик; ПААГ, обработанный мукопротеинами слюны; ПААГ, обработанный каким-либо другим типом гликопротеинов; нитроцеллюлозная мембрана, обработанная каким-либо гликопротеином; гель (акриламидный, агарозный или другой), в состав которого включены определенныее углеводн ые группы; необработанная нитроцеллюлозная мембрана и т.д.На поверхность реплики наносят каплями по 2-10 мкл изучаемый раствор белков, содержащий лектины, Через 10-20 мин реплики промывают физраствором и помещают в суспензию эритроцитов, При оптимальных для изучаемого лектина условиях осуществления способа на месте нанесения образца появляется ярко-красное пятно. В случае АЗП оптимальной является реплика, состоящая из ПААГ, содержащего мукопротеины слюны и обработанного глутаровым альдегидом для связывания мукопротеинов с ПААГ,Проводят изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) белков в 6-ном ПААГ толщиной 0,2 мм, содержащем 2) амфолина с интервалом рН. 3-10. Образцы наносят на гель с помощью полосок фильтровальной бумаги в объеме 1-20 мкл. Полимериэуют 6;-ную ПААГ-реплику толщиной 0,2 мм на пластиковой подложке. Реплика содержит 0,9; йаС в фосфатном буфере рН 7,5. Реплику обрабатывают в течение минуты мукопротеинами слюны человека. Затем 20 25 30 35 40 45 50 55 реплику накладывают на 40 мин на бумагу, смоченную 10;-ным глутаровым альдегидом. Реплику ополаскивают в физрастворе 5-10 мин и слегка подсушивают для удаления капель влаги. После ИЭФ на разделяющий гель накладывают гель-реплику на 10-30 мин. Затем реплику погружают в суспензию (1-4 по объему) эритроцитов кролика. Через 5-20 мин на поверхности гель-реплики появляются четкие ярко-красные полосы, образованные эритроцитами, связанными с лектинами,На разделяющий гель после реплики накладывают фотопленку на 20 мин и проявляют ее трипсином для идентификации компонентов ингибиторов трипсина. Изоточки лектинов и ингибиторов трипсина из зародышей пшеницы несколько отличаются,Таким образом, предлагаемый способ в отличие от прототипа позволяет идентифицировать в спектре белков компоненты лектинов и наличие примесей белков с иной специфичностью не влияет на результаты,П р и м е р 2. Идентификация компонентов лектина фасоли.Выбор оптимального варианта реплики проводят, как в примере 1, Для лектина фасоли наиболее оптимальной репликой является необработанная нитроцеллюлозная мембрана,Проводят ИЭФ препарата лектина фасоли. На разделяющий гель накладывают необработанную нитроцеллюлозную мембрану. После переноса белков за счет диффузии (10-20 мин) мембрану погружают в суспензию эритроцитов. Компоненты лектинов фасоли проявляются в виде ярко-красных полос, В этих же условиях АЗП выявляются очень слабо, т.е, чувствительность данного варианта способа достаточна для лектина фасоли и недостаточна для АЗП,Использование предлагаемого способа обеспечивает по сравнению с прототипом следующие преимущества.Повышение достоверности и разрешающей способности анализа при идентификации компонентов лектинов. Компоненты лектинов выявляются непосредственно на реплике с разделяющего геля и примесь других белков не влияет иа результаты.С одного геля можно снять несколько реплик, обработанных разными гликопротеинами или углеводами для идентификации разных типов лектинов; желатиновые реплики для идентификации ингибиторов протеиназ, реплики, содержащие субстраты для идентификации различных ферменов и их ингибиторов и т,п.Заказ 1487 Тираж 513. Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 Упрощение и повышение производительности анализа, сокращение его и родолжительности, Отпадает необходимость очистки лектинов, На одном геле можно одновременно анализировать 20-30 образцов суммарных экстрактов белков, содержащих лектины, Идентификацию компонентов лектинов можно провести за 20-30 мин после ИЭФ.Формула изобретения Способ идентификации лектинов, включающий фракционирование белков в гелях, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и повышения разрешающей способности анализа, перед фракционированием белков предварительно подбирают состав реплики, оптимальный для связыва ния определяемых лектинов, а после фракционирования белки из разделяющего геля переносят на реплику, с которой лектины связываются, затем реплику погружают в суспензию эритроцитов и идентифицируют 10 лектины на реплике по ярко-красным полосам, образованным эритроцитами, причем фракционированию подвергают неочищенные белки,