Способ выделения 5 -нуклеотидазы из яда кобры

СОЮЗ СОВЕТСКСОЦИАЛИСТИЧЕРЕСПУБЛИН 01 А 5 С 2 Г 19 Г,ьс .Е А ВТОРСНОМУ ДЕТЕЛЬСТ Бюл. с 7имическойАН ЗССРЗ.З. Аави и биолог ар Метод онуклеары 5 ю Райт В. щенной ри атской ко химия, 197 583. ИЯ 5 -НУКЛ(57) Изобре ной промьшсл лучению чис ,кобры - спе сится к ферм частности к леотидазы яд о Фермента, 5 -рибонуклет- оности,й 5 -ну т с иче гидролиз сц лиз ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗ(71) Институт хческой Физики(56) Василенко С.К.выделения высокоочизы из яда среднеазиГ 1,1 а охапа, - Биот. 40, У 3, с. 578 -(54) С 11 ОСОБ ВЫДЕЛЕЗЫ ИЗ ЯДА КОБРЫ Изобретение относится к ферментной промьппленности, в частности к получению чистой 5 -нуклеотидазы ядакобры - специфического фермента, катапизирующего гидролиз 5 -рибонуклеотида до рибонуклеозида и ортофосфата(высокая специфичность 5 -нуклеотидады делает ее препаратом при исследовании структуры нуклеиновых кислот),Цель изобретения - упрощение спо-,соба и повыпсение чистоты целевогопродукта за счет разделения 5 -нуклеотидазы от неспецифической Фосфомоноэстераэы,2да до рибонуклеозида и ортофосфата. Высокая специфичность 5 - нуклеотидазы делает ее препаратом при исследовании структуры нуклеиновых кислот.Целью изобретения является упрощение способа и повьппение частоты целевого( продукта за счет разделения 5 -нуклеотидазы от неспецифической Фосфомоноэстеразы. Способ включает растворение яда кобры в буферном растворе с последующим центрифугированием и хроматографированием на гептил-агарозе с использованием в качестве буфера 0,35-0,45 М раствора сульфата аммония, рН 6,5-7,5. 5-Нуклеотидаза элюируется после основного количества белка. Выход 90%, степень очистки - 25, содержание фосфодиэстеразы и неспецифической фосфомоноэстеразы менее 0,05% активности 5-нуклеотидазы, 1 з,п, Ф-лы, 1 ил. Способ включает растворение яда 4 ф кобры в буферном растворе с последую- Вйь щим центрифугированием при 5000 об/мин Яб и хроматографирование раствора ядана гептил-агарозе, причем растворение рвы яда и хроматографисо осуществляют. сиспользованием в качестве буфера 0,35- 0,45 Г 1 раствора сернокислого аммония (рН 6,5-7,5) и 5 -нуклеотидаза элюируется после основного количества бел(ка, полученный раствор 5 -нуклеотидазы концентрируют при ультрафильтрации,При концентрации сернокислого аммония в элюенте ниже 0,35 М часть5 -нуклеотидаэы проходит колонку геп гил-агарозы, и выход резко понижается, При концентрации сернокислого аммония выше 0,45 начинается адсорбция фосфодиэстеразы на гептил-агарозе, как и при рН выше 7, 5, При рН ниже 6,5,5 -нуклеотидаза инактивируется.Использование сернокислого аммония В качестве буфера на стадии растворения яда обеспечивает создание подходящей среды для последующего разделеия на гептил-агарозе. Концентрация аствора сернокислого аммония 0,35- ,45 М является самой высокой конентрацией, которая позволяет исклюить адсорбцию остальных нуклеаз (неспецийической фосйомоноэстеразы и Фосфоэстерзы), а также является практически самой низкой концентрацией, которая обеспечивает полное связыва ние 5 "нуклеотидазы на. гептил-агарозе и ее элюирование после основного количества белка, Самые лучшие результаты разделения 5 -нуклеотидазы 25 от неспецийической фосфомоноэстеразы реализуются в интервале рН 6,5-7,5.Из алкил-агароз оптимальным сорбентом является гептил-агароза. Нагексил-агарозе 5 -нуклеотидаза связы 30 вается слишком слабо, что не обеспе.чивает полноту разделения от компонентов яда и высокий выход, а на октилагарозе частично связывается фосфодиэстераза, и градиентное элюирование не гарантирует полное разделение 5 нуклеотизады от Фосйодиэстеразы, Хро,матография на гептил-агарозе обеспе чивает практически полное разделение40 5 -нуклеотидазы от неспецифической фосйомоноэстеразы и йосфодиэстеразы (см.чертеж), Способ заключается в следующем. Яд кобры растворяют в растворе 0,35-0 р 45 М сернокислого аммония (рН 45 6,5 - 7,5), центрийугируют при 5000 об/мин при 4 С в течение 30 мин, осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии. Хроматограйию проводят на гептил-агарозе в растворе 0,35-0,45 М сернокис 50 лого аммония (рН 6,5-7,5) .5 -Нуклеотидаз а связывается на кол онке гептилагарозы и элюируется после основного белка 0,35-0,45 М раствором серно 55 кислого аммония(рН 6,5-7,5), Полученный йермент концентрируется при помощи ультрайильтрации.Характеристика препарата: выход 90%, степень очистки -в 25 раз Содержание фосфодиэ.теразы и неспецифической и Ьосйомоноэстеразы ниже 0,05 от активности 5 -нуклеотидазы,П р и м е р 1. К, 0,5 г яда кобрыдобавляют 4 мп раствора 0,35 М сернокислого аммония (рН 6,5), смесь медленно перемешивают в течение 4 чопри 4 С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4 С в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии, На уравновешенную 0,35 Мраствором сернокислого аммония (рН6,5), колонку с гептил-агарозой (размеры колонки 2,1 ю 2,6 см) наносят раствор яда, Колонку элюируют 0,35 М раствором сернокислого аммония (рН 6,5)со скоростью 26 мл/ч, отбирают фракции по 13 мм. Оптическую плотностьэлюата регистрируют непрерывно с помощью "Увикорд". НеспецифическаяФосфомоноэстераза, фосфодиэстераза,рибонуклеаза и основное количествобелка в данных условиях проходят колонку, а 5 -нуклеотидаза, имеющая оптимум гидрофобности в данных условиях, связывается на гептил-агарозе иэлюируется раствором 0,35 М сернокислого аммония при рН 6,5, Фракции,имеющие 5 -нуклеотидазную активность,объединяют (выход 310 мл) и концентрируют ультрафильтрацией.Характеристика препарата: выход901, степень очистки - в 25 раз,Удельная активность препарата 5 -нуклеотидазы 60,0 ед/мг, Содержание фосфодиэстеразы 0,05(3 1 О ед,/мг).Содержание неспецифической фосфомоноэстеразы 0,05% (310 ед./мг),П р и м е р 2, К О 5 г яда кобры добавляют 4 мл раствора 0,40 М серно" кислого аммония (рН 7,0), смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 4 С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4 С в течение 30 мин, Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии, На уравновешенную 0,04 М раствором сернокислого аммония (рН 7,0) колонку с гептил-агарозой (размеры колонки 2,1 2,6 см) наносят раствор яда. Колонку элюируют 0,440 И раствором сернокислого аммония (рН 7,0 со скоростью 26 мл/ч, отбирают Фракции по 13 мп. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерьпно с помощью "Увикорд". Неспецифическая фосфоЯО би основное количество белка проходятв данных условиях колонкуа 5 -нуклеотидаза, имеющая оптимум гидрофобности в данных условиях, связываетсяна гептил-агарозе и ее элюируют раствором 0,45 М сернокислого аммонияГпри рН ,5, фракции, имеющие 5 -нуклеотидазную активность, объединяют(выход 307 мл) и концентрируют ультрафильтрацией,Характеристика препарата; выход90%, степень очистки - в 25 раз,Удельная активность препарата 5 -нук"леотидазы 60,1 ед,/мг. Содержаниефосфодиэстеразы 0,0422 (2,510 ед./мг) 5 544моноэстераза, Фосфодиэстераза, рибонуклеаза и основное количество бел-,ка проходят в данных условиях колонкуф5а 5 -нуклеотидаза, имеющая оптимумгидрофобности в данных условиях,5связывается на гептил-агарозе и ееэлюируют 0,40 И сернокислого аммонияпри рН 7,0. Фракции, имеющие 5 -нуклеотидазную активность, объединяют(/препарата 5 -нуклеотидазы 60,7 ед,/мг.Характеристика препарата: выход90 Х, степень очистки - в 25 раз. Со-. 15держание фосфодиэстеразы 0,0462 (2,81к 10 ед./мг). Содержание неспецифической Фосфомоноэстеразы 0,00073(4,5 10 ед./мг)11 р и м е р 3. К 0,5 г яда кобры 20добавляют 4 мп раствора 0,45 М сернокислого аммония (рН 7,5), смесь медленно перемешивают в течение 4 чпри 4 С. Растворенный яд центрифугиоруют при 5000 об/мин при 4 С в течение 30 мин, Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют дляхроматографии. На уравновешенную0,45 И раствором сернокислого аммония (рН 7,5) колонку с гептил-агарозой (размеры колонки 2,152,6 см)наносят раствор яда. Колонку элюируют 0,45 М раствором сернокислогоаммония (рН 7,5) со скоростью .26 мл/ч, собирают Фракции по 13 мл,Оптическую плотность элюата регистри35руют непрерывно с помощью "Увикорд 11". Неспецифическая фосфомоноэстераза, фосфодиэстераза, рибонуклеаза Формула и з о брет ения/1. Способ выделения 5 -нуклеотидазы,из яда кобры, включающий растворение яда кобры в буферном растворе, центрифугирование с последующей очисткой супернатанта методом хроматографии с разделением от сопутствующих белков, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения чистоты целевого продукта за счет разделения 5, -нуклеотидаз от неспецифической фосфомоноэстеразы, растворение яда кобры осуществляют в 0,35-0,45 М буферном растворе сульфата аммония при рН 6,5-7,5, а хроматографическую очистку выполняют на гептил-агарозе в: 0,35-0,45 М растворе того же буфера.2. Способ по и,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что центрифугирование проводят при 5000 об,/мин.Составитель А, Семенодактор В. Дацко Техред М.Дидык Корректор Н. Король 11 Тираж 479Государственного комитета по и 11.3035, Москва, Ж-Э 5,Подписноетениям и открытиям при ГКНТ СССская наб., д, 4/5 акачНИИПИ оизводственно-и брательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 10