Способ детекции нуклеиновых кислот

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 80538126 51)560103 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ Я ВИДЕТЕЛЬСТВ К АВТОРСКОМ ие способа неради и детекции нуклеи ть изобретения со вле н ущно то в етик ачест етки к иняют ги СО - % кислощей Фо,В,Карпухин, Нпитковский12.015 (088.8асмой, КР е1 о 1, 1986, ч.ОСОБ ДЕТЕ п,311-317.ВЫХ детекции метки проХ 02 инойм-глиокислендят обработ клеиновой к у модиФициров слоты Фермент редварительно м натрия с по ем образующег тивной реакции мо можетластяхиоактив теидом,ерииодатпределен ым едую щим о дукта ся про т. удеерм рия, либоерментомительного ом окисленным перииод проводят такую обра гликопротеидом без окисления перииодачСпособ осуществ. я к молекуике и можетгих областях относити и гене Изобретен лярной биоло быть использ отку редв ано в дрицины дл детекци ом натрия, яют следующим о ерадиоактивуклеиновых биологии и меного мечения разом,В качестве метки к ну кислоте присоединяют мол жащую гидразид общей Фор ис от.ель изобревление сечения и ения соба текци еинов ощени екулу, содулы адиоактивно нуклеиновых о ислотЦ д что в кавой кислоте для ее де-. ку модифицислоты ферменется т нуклеи дразид обраб новой 1 Н, 1 Н СО (СН,) честве метки кприсоединяют гитекции проводярованной нуклетом-гликопроте рительно дом, и ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Институт медицинАМН СССР(54) СП КЦИИ НУКЛЕИНОКИСЛОТ(57) Изобретение относится клярной биологии и генетике ибыть использовано в других оббиологии и медицины для нерадного мечения нуклеиновых кислЦель изобретения - упрощение оактивного леновых кислот. стоит в том, нуклеиновой дразид об - ИН, где в (СН )п-;Для детекции метки проводят обработку нуклеиновой кислоты ФерментомФгликопротеидом, оксо-группы которогоковалентно связываются гидразиднымигруппами метки. При этом для окисления гидроксильных групп фермент-гликопротеид предварительно обрабатывают перииодатом натрия, либо прнналичии оксо-групп в составе Фермента такую обработку не проводят.К пробам нуклеиновых кислот с иммобилизованным ферментом добавля,ют субстрат, проводят ферментативнуюреакцию и количество нуклеиновых кислот определяют по интенсивности окра,шивания образовавшегося продукта.Аналогичным образом определяют гомологичные нуклеиновые кислоты послеих предварительной гибридизации смеченой. ферментом нуклеиновой кислотой,П р и м е р 1. Введение гидразид ной метки в нуклеиновую кислоту.А. Включеще по положению С25цитозина. 10 мкг денатурированнойДНК растворяют в 50 мкл воды и добавляют 50 мкл водного раствора дигидразида адипиновой кислоты (концентрация. 160 мг/мл) в смеси с бисульфитом натрия (380 мг/мл) иливодного раствора карбазида (360 мг//мл),Реакционную смесь инкубируют2 ч при 37 С и проводят очистку с помощью гель-Фильтрации на сефадексе35С.Б. Включение с помощью фотореагента, 1 О мкг ДНК растворяют в 50 мклводы й добавляют 10 мкл 0,00 М раствора гидразида 4-азидо-нитробенэойной кислоты. Смесь облучают видимымсветом в течение 30 мин и проводятгель-фильтрацию на сефадексе С.П р и м е р 2. ДНК, содержащую . 45гидразидные группы и контрольную немеченую ДНК, наносят на нитроцеллю.лозный Фильтр в количестве 1 нгпг и25 нг соответственно, Фильтры прогревают 2 ч при 80 С. Далее выдерживают в буфере А (0,01 М ацетат натрия,рН 4,3, 0,1% твин) в течение20 мин и обрабатывают предварительно окисленной или неокисленной пероксидаэой в течение 10 мин в буфе 55ре А без твинпри комнатной температуре, Окисление пероксидаэы проводят обработкой периодатом натрия(4 мг/мч) в течение 5 мин, после чего избыток реагента удаляют гельфильтрацией на сефадексе С, Фильтры отмывают буфером А 3 раза по10 мин и затем добавляют смесь диаминобензидина (0,5 мг/мп) и перекисиводорода (0,03%) в 01 М буфере трисНС 1, рН 7,5. Инкубируют в течение30-60 мин. Чувствительность определения ДНК меченой дигидразидом адипиновой кислоты составляетпг приотсутствии сигнала на контрольной немеченой. пробе.При использовании меченой гидра-зидом ДНК дпя гибридизации нитроцел"люлоэный фильтр с образцами ДНК, гомологичной меченой, нанесенной в ко;личестве 1-20 пг, и негомологичнойДНК (25 пг) обрабатывают буферомБ (0,6 М ЯаС 1, 0,002 мг/мл поливинилпнроллидон, 007 М натрий-фосфатныйбуфер, рН 7,5, 10 мкг/мл РНК,50% формамид) в течение 1 ч при 37 С. Далеепроводят гибридизацию в буфере Б,содержащем ДНК, меченую . гидразидом (пример 1 А) (100 нг/мн) при37 С в течение 16 ч, Далее фильтр отмывают буфером В (0,07 М натрий-фосФат, 0,1 М НаС 1, 0,5% додецилсульфат натрия, рН 7,5) при комнатнойтемпературе 3 раза по 10 мин и буфером В, содержащим МаС 1 в концентрации 0,05 М при 48 С в течение 1 ч,Затем фильтры выдерживают в буфереА, содержащем 0,1 М аС 1, в течение30 мин и обрабатывают ферментом, какописано выше,.Чувствительность определения составляет 20"50 пг при отсутствии сигнала на негомологичнойДНК,П р и м е р 3, Фильтры.снанесен.ной ДНК, содержащей гидраэидные группы (0,01 пг - 1 нг) и немеченойДНК - 50 нг, выдерживают в буфереГ (0,1 М ацетат натрия, рН 5,2,0,5% твин) в течение 1 ч и обрабатывают предварительно окисленной-галактоэидазой в течение О мин вбуфере Г без твинпри комнатнойтемпературе, Окисление галактозидаэыпроводят обработкой периодатом натрия (4 мг/мл) в течение 5 мин в0,1 М натрий-фосфатном буфере,рН 6,5; реакцию блокируют добавлением глюкозы, Далее фермент очищают гель-фильтрацией. Фильтры отмывают буфером Л (0,1 М натрий-Фосфат,рН 7,5) с добавлением 0,05% твин 2 раза по 5 мин и однократно буфе3826 Ьее проникновения к меченой нуклеино-вой кислоте, Это преимущество имеетнаибольшее значение при использова"нии меченых нуклеиновых кислот длягибридизации Ывдц,Чувствительность, обеспечиваемаяпредлагаемым способом, аналогичначувствительности при использовании .1 О в качестве метки биотина и конъюга-.та стрептавидин-пероксидаза для детекции.Таким образом, предлагаемый способ уменьшает стоимость нерадио 15 активного мечения и детекциинуклеиновых кислот и упрощает его,так как позволяет отказаться от ис"пользования молекул-посредников.(биотина и авидина) и операций поих использованию, Кроме того, улучшает возможности детекции с помощьюферментов при нерадиоактивном мечении, что обусловлено уменьшением молекулярных масс и размеров метки нануклеиновой кислоте и соединения-детектора.формула изобретения Способ детекции нуклеиновых кислот, включающий введение метки в нуклеиновую кислоту, последующую обработку ее ферментом и определениеколичества образующегося продуктаферментативной реакции, о т л и - 35 ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения и удешевления способа, вкачестве метки используют гидразидобщей формулы 40К- С 0-ННН урат Корректор Т,Малец 515ром Д (5 мин). Добавляют смесь 5-бро"мо 4-хлор-индолил-галактозид(0,3 мг/мй) и нитротетразолевый синий (0,4 мг/мп) в буфере Д, Инкуби"руют 2-4 ч, Чувствительность определения меченой ДНК составляет 0,1,пгпри отсутствии сигнала на контрольной пробе (50 нг).Выбор фермента-гликопротеида прииспользовании способа определяетсяособенностями решаемых задач и может быть связан с такими характеристиками ферментов, как стоимость, стабильность, размеры, необходимые идоступные субстраты и т,д., а такженеобходимый и обеспечиваемый уровень чувствительности,Предлагаемый способ позволяет использовать в качестве метки нуклеиновой кислоты молекулу меньшую, чембиотин примерно в 8 раз. Посколькугидразид может быть присоединен кнуклеиновой кислоте теми же способами, что и биотин, это уменьшает загрузку меченой нуклеиновой кислоты и,следовательно, изменение ее свойств,а также существенно удешевляет способ.Например, стоимость эквивалентныхколичеств реагентов при мечении нуклеиновых кислот по положению Сцитозина с использованием в качествеметки гидразида уменьшается болеечем в 100 раз по сравнению с мечением биотином (каталог фирмы 88 ша,США, 1987, сравниваются дигидразидадипиновой кислоты и гидразид биотина). Эффект достигается и вследствие отказа от необходимости использования комплекса стрептавидинфермент, Так, стоимость конъюгатастрептавидин-пероксидаза и пероксидазы при одинаковой активности соотносятся как 20:1 (каталог фирмыЯдрпа, США, 1987). Присоединениестрептавидина к пероксидазе увеличивает молекулярную массу молекулыдетектора в 2,5 раза. Следовательно,в предлагаемом способе молекула-детектор имеет меньшие размеры, чтообеспечивает улучшение возможностиСоставитель А.СкРедактор Н,Тупица Техред М,Ходанич где К-ИН -ИН-; МН -ИН-СО-(СН); а обработку проводят ферментом - гликопротеидом,Заказ 167 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издатель кий комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,10