Способ флуоресцентной детекции иммобилизованных нуклеиновых кислот

Номер патента: 1613493

Авторы: Вейко, Карпухин, Потапов, Спитковский

ZIP архив

Текст

эидаэу. Присоединение осуществлягот сц пользованием способцости окисле иных периодатом натрия углеводных ос - тдтков, содержащихся в составе-галдктозидаэы, к химической реакции с гидразидом с образованием ковалецтцой связи. К другой метке (биотину) Фермент щелочную Фосфатазу присоединяют с помощьго молекулы-посредника стрептдвидица, обладающего высоким средством к биотину. В качестве субстрдтов указанных Ферментов применя - ют 4-метгглумбеллиферил, галактозцд и Алуоресцсиндифосфдт, обладдгощий шг гкоц флуоресцецпгей, которая знагцггельцо возрастает при отщеплеции 9-гдлдктозцццых и Фосфатцых групп.1 д и.цчие спектров эмиссии продуктов р с д кгоги, катали зцр уемой Ферментами, позволяет проводить регистрацию со-рждшгя каждого из цих в смеси и, следовательцо, определять содержание мечецшгс ДИК- зоггдов.П р и гг е р 1. лиЬ 5 ерегигггальное опр едел ение ИК, меченной гидра зилом и биотицом в одном образце.ДНК, меченную карбогидразидом по цоложешгю 0-4 цитозина (ЛНК Т) и ме- чсцП и биотицом с помощью фотоактинируеггого редгецта (ДИК 11) наносят цд гцгтроцеллгоцозцые Фильтры по отдельности и совместно в одном пятне н количествах от 100 пг до О, 1 пг с цосителегг (100 нг цемеченной контрольной ДНК), д также отдельно контрольцую ДНК (100 цг). Иммобилизацию проводят прогреванием в течение часа прц 80 С. Далее фильтры выдерживают 30 миц в среде 0,1 М ацетата натрия, рН 5, 1, О, 5 твини обрабатывают предварительно окисленной периодатом натрия 3 -галдктозцдазой (10 ед/мл) в том же буфере без твинпри 25 С в течение 10 миц, после чего отмывают раствором 0,05 М натрий фосфата, рН 7 5 0 1 М ГаС 1 5 мМ Г 8 С 1 г 0,05 твццтри раза по 5 мин, Затем обрабатывают коцьюгатом стрептавцдин - щелочная Ьосфатдза в растворе 0,1 М трис-ИС 1, рН 7,5, 0,1 М Г 1 аС 1, 5 мМ Г 1 еС 1 15 минут при 25 С и отмывают этим же раствором с добавлением 0,05 твин3 раза по 10 мин. Каждый кусочек Фильтра с пятном ДИК переводят в 0,5 мл буфера 0,05 М трис-ИС 1, рН 8,2, О, 1 Г 1 Г 1 аС 1,м МвС 1, содержащего метил умбсллиферилгала ктоэид(20 гкг/икл) . Выдерживаютч прио25 С и измеряют интенсивность Флуорс спеццци метилумб цтиферона (Я о. в= - 360 цм; Ъ з,ииссии = 450 нм) и Флуоресцеица (Ъ вом 490 цм; / миссии = - 510 цм) . Зависимости интенсивности Флуоресценции от количества ДНК ца Фильтре показывают близкие значения при определении ДИК с разцымц метка - ми в одном пятне и цацесецными по отдельности. Интенсивность Флуоресцецции Флуоресцеица для гидразцдной ДНК ц 4-метилумбеллиферона для биотинировацной ДНК соответствует Фоновым значениям и це зависит от концентрации модифицированной ДИК. Сле - довдтельцо, отсутствуют перекрестное взаимодействие и Факторы, препятствующие детекши ра гличных меток в одном пятне. Чувствительность способа позволяет определять до 0,1 пг меченной ЛНК.П р и м е р 2. Количественное определение двух различных последовательностей ДИК в одном образце.Для построения калибровочцой кривой ца цитро целлюлоз ггм Фил ьтре иммобилиэуют смесь ДНК двух немеченцых гибрцдизациоцшгх зондов (по 100 пг 1 пг) в присутствии 100 цг дендтури роваццой цегомологичной ДНК, Гибридизацию с меченными гидраэидом и биотином зондами (ДНК -ГН-ГН и ДНК -2 В соответствс нно) проводят в буфере, содержащем 0,6 М Г 1 дС 1, 0,2 мг/мп поли винилпирр олид она, О, 07 Г 1 натри йфосфат, рН 7,5, 500 мкг/мл РНКу 50 Формамида и по 100 цг/мл каждого зонда в течение 16 ч при 37 С. После отмывки в буфере, содержащем 0,5 додецилсульфата натрия, 0,05 Г 1 ХаС 1 О, 07 натрий-фосфата, рН 7, 5, при 48 С в течение часа, фильтры обрабатывают, как описано в примере 1.Затем строят зависимость интенсивности флуоресцецции от количества немеченной ДНК для каждого зонда. После проведения гибридизации данных зондов с геномной ДНК, нанесенной на фильтры в количестве 100 гг и 500 цг, по полученным значениям Флуоресценции и использованием калибровочцой кривой определяют содержание гомологичных последовательностей в образце, Содержание ЛИК-ГИ-Г 1 Н в 100 цг геномцой ДНК составляет 60-80 нг, ЛНК-Б 1-2 пг, ВЗаказ 3867 Тираж 487 Подпис ноеВНИИ 11 И Государ твенного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул . Гагарина, 10 1 500 нг геномной ДНК содержание ДНК-В определяют в количестве 5-7 пг,Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить дифференциальную детекцию двух различных последовательностейт ей нукл еи новых кислот в одном образце и с высокой чувствительностью определять их количестСпособ флуоресцентной детекции иммобилизованных нуклеиновых кислот, включающий гибридизацию с иммобилизованной ДНК двух меченных ДНК-зондов, с последующей детекцией меток, о т Л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повьшения эффективности способа за счет одновременнс й детекциш двух зондов в одном образце и унели - чения стабильности зондов, гибриди зацию проводят зондами, один пз которых метят гидразидом, а другой биотином с последующей обработкой

Смотреть

Заявка

4492807, 14.10.1988

ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ ГЕНЕТИКИ АМН СССР, НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ "БИОТЕХНОЛОГИЯ"

ПОТАПОВ ВИКТОР КУЗЬМИЧ, ВЕЙКО НАТАЛЬЯ НИКОЛАЕВНА, КАРПУХИН АЛЕКСАНДР ВАСИЛЬЕВИЧ, СПИТКОВСКИЙ ДАВИД МИХАЙЛОВИЧ

МПК / Метки

МПК: C12Q 1/68

Метки: детекции, иммобилизованных, кислот, нуклеиновых, флуоресцентной

Опубликовано: 15.12.1990

Код ссылки

<a href="https://patents.su/3-1613493-sposob-fluorescentnojj-detekcii-immobilizovannykh-nukleinovykh-kislot.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ флуоресцентной детекции иммобилизованных нуклеиновых кислот</a>

Похожие патенты