Способ иммобилизации нуклеиновых кислот

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 5 А 19) (11 ОБРЕТЕНИЯ ОПИСАНИ К АВТОРСКОМУ ЕТЕЛЬСТ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ:А РВА-всту 1 аш 1 де ве 1 со 1 цаа Готапа 1 увтпа ртоте 1 пв сЬат Ъ 1 пд тоРНА.1 ОНА-ро 1 уаетаве. Ртос, Мат,АсейЯс, дЯА 67, 807-812, 19702, Рооц 3.ап М.Я., ЯсЬ 1 аЪвсЬ,ЮИе 1 ввЬасЬ А СочайепС вССасаепС оГ: пцс 1 еХс вс 1 йв Со вввгове Кот аН 1 мтусЬговвСо 8 гарЬу В 1 осЬеа 1 еСгу, 10,424-427, 1971,З.КоЬетвоп 0.1 Пачтдвоп Я.,Соча 1 епт соцр 11 п 8 оГ т 1 Ьопцс 1 е 1 с,асИ то ааатове. В 1 осЬеа 1 втту, 11,5331972.4, ВеггЫЯе М,О. Агопвоп А.1.,Ап авеау;т"ог СЬе епйопцс 1 ео 1 уС 1 сс 1 евчаее оГ ЭКА Со 1 ацге о 11 копас 1 еоС 1 йее,. Апв 1. ВхосЬ, 53, 603-612,1973.,РгервгаС 1 оп апй цве от ВБА-се 11 ц 1 оеесо 1 цапв, Апа 1. В 1 осЬ. 48,. 27-32;1972.( 54 ) ( 57 ) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ВУАЯЖ ИНОВЫХ КИСЛОТ, включавший сорбцию нуклеиновых кислот из водных растворов на целлюлозу, обработку, приводящую к ковалентному связыванию нуклеиновой кислоты с целлюлозой, и отмывку продукта водными растворами Яас 1 и. водой, о т л и ч а ю:- ". ц и й с я тем, что, с целью упроюения процесса, увеличения содеркания нуклеиновых кислот в готовом продукте; увеличения выхода по связыванию РНК и повышения устойчивости продукта к действию нуклеаэ, сорбцию нуклеиновых кислот проводят, на аминоэтилцеллюлоэе при 60-100 С в течение 15-40 мин с последующим введением в реакционную смесь глутарового альдегида до содержания его в смеси, равного 0,25-4, и выдерживанием смеси при 20-100 оС в течение 120-10 мин.СИзобретение относится к областибиохимии, а игленно к способам иммобилизации нуклеиновых кислот, Способ может быть пригленен для получения эффективных сорбентон для аффинной хроматографии белков,.Известен способ иммобилизациинуклеиновых кислот путем включенияих н гранулы полиакриламидного геля Г 13.Недостатками этого способа являЮтся низкое содержание нуклеиновой кислоты в препаратах, неустойчивость препаратов к действию нуклеаэ,невозможность иммобилизации низкомолекулярных нуклеиновых кислот иплохие гидродинамические свойстварепаратов,Известен ряд способон иммобилизации нуклеиновых кислот посредствомсвязывания их с активированнойматрицей 2-4 3. Эти способы сводятся к следующему:г гидрофильную матрицу, чаще всего агарозу,обрабатынают бромистым цианом сцелью активации, затем промываютнодными растворами солей (ИаС 1или КС 1) и водой, К актинированнойматрице приливают раствор нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК)й инкубируют смесь. Затем промывают препараты водными растворамисолей (НаС 1 Или КС 1) для удалениянесвязаншихся нуклеиновых кислот,Таким образом, получают препараты иммобилизованных нуклеиновых кислот с содержанием ДНК илиРНК 0,3-0,6 мг/г матрицы (0,050,1 мг 7 мл геля). Полученные прегараты подвержены действию нуклеаз и период их пблужизни составляет 5-10 дней нативную ДНК такимспособом иммобилизовать невозможно.Недостатками этйх способов являются использование токсичноговещества, бромистого циана, низкоесодержание нуклеиновых кислот впродукте, нестабильность препаратов при взаимодействии с нуклеазами,невозможность иммобилизации нативной ДНК. Известен также способ иммобилиэа; ции нуклеиновых кислот, ДНК и РНК 5 3, заключающийся в том, что порошок целлюлозы пропитывают растворами нуклеиновых кислот, смесь размазывают тонким слоем и сушат в токе воздуха н течение 16-24 ч, Затем сухой продукт суспендиругггт в спирте и суспензию облучают ртутной лампой мощностью 100000 эрг/глм 2 в течение 15-30 мин, Спирт отфильтровывают, готовый продукт промывают нодным раствором НаС 1 и водой, Выход по связыванию ДНК 90, по связыванию РНК 23-25. Этим способом получают препараты, содержащие 13 мг ДНК/г матрицы и 1 мг РНК/гматрицы.Недостатками этого способа являются длительность получения препарата (2 сут) низкое содержа 5 ние нуклеиновых кислот в готовомпродукте, низкий выход по связыванию РНК и ниэкая устойчивостьпродукта к ноэдействию.нуклеаз.Цель изобретения - упрощение10 процесса иммобилизации, увеличение содержания нуклеиновых кислот вготовом продукте, увеличение выхода по связыванию РНК и повышениеустойчивости продукта к действиюнуклеаз,Цель достигается эа счет того,что сорбцию нуклеиновых кислот производят на аминоэтилцеллюлозе при60-100 С в течение 15-40 мин с пооследующим введением н реакционнуюсмесь глутарового альдегида до содержания его в смеси, равного 0,254, и вцдерживанием смеси при 20100 С н течение 120-10 мин,Процесс проводят следующим образом,В качестве носителя берутАЭ-целлюлозу отечественного производства (Биохимпрепарат, г,Олайне)или производства "Реаналф (Венгрия),Иммобилизации подвергают ДЯК иэ тимуса и молок лососевых рыб (СКТБ БАВи КосЬ-ЬйС и РНК из печени иЕ,со 11 МНЕ(СКТБ БАВ).Способ нключает следующие стадии.35 1. Нуклеиновые кислоты (ДНК илиРНК) собирают иэ водного растворана АЭ-целлюлоэе н течение 15-40 мин,Содержание нуклеиновых кислот в водном растворе составляет до 60 мг/мл;40 Увеличение времени сорбции от 15 до40 мин позволяет получить препарат сболее высоким содержанием нуклеиновых кислот, Дальнейшее увеличениевремени сорбции практически не приводит к унеличению связывания нуклеиновых кислот, Уменьшение времени(менее 15 мин) приводит к получениюпрепарата с низким содержанием кукле.иновых кислот, что нежелательно,2, Обрабатывают получаенную суспензию нерастворимого комплексаАЭ-целлюлоза - нуклеиионая кислотаводным раствором глутарового альдегида при 20-100 С в течение 12010 мин, Концентрацию глутарового альдегида в реакционной смеси поддерживают равной объемным 0,25-4,0, Укаэанные концентрации глутароного альдегида оптимальны и свойства полученных препаратов идентичны, Уменьшение60 концентрации приводит к увеличениюрабочих объемов, а увеличение концентрации создает неудобства приперемешивании массы. Перемешинаниенеобходимо для равномерного распреде65 ления глутароного альдегида пообъему, Увеличение температуры иммо-билиэации приводит к сокращению вре.мени обработки,3. Полученную суспенэию отфильтровывают на фильтре водным растворомБаС 1 и водой для удаления несвязавшихся нуклеиновых кислот,Таким образом, иммобнлиэуется80-90 нуклеиновых кислот, внесенныхв реакционную смесь. Содержаниенуклеиновых кислот в препаратах составляет до 130 мг/г сорбента. Способ позволяет получать препараты,содержащие заданное количество нуклеиновых кислот. Длительность процесса пблучения иммобилиэованныхнуклеиновых кислот составляет 0,53 ч в зависимости от условий реакции.Препараты иммобилиэованных нуклеи. Новых кислот на АЭ-целлюлозе устойчивы к действию нуклеаэ как в условиях хроматографии, так . и в жесткихуслойиях, при исчерпывающем гидролизе их нукдеазой Беггас 1 а вагсевсепв(20 ч прн температуре 37 С). В условиях хроматографии сродства на колонке иммобилиэованной днк препаратов терминальной дезоксинуклеотидМлтрнасфераэы иэ тимуса, содержащих примеси нуклеаз, иммобилиэованная Днк йолностью стабильна и полу-.чаемый препарат Фермента не содержит примесей нуклеиновых кислот.При исчерпывающем гидролиэе иммобилизованных ДНК и РНК нуклеаэойЯегга 1 а щагсевсепв от препаратов,содержащих денатурированные ДНК иРНК отщепляется 10-18 нуклеотидного материала, а от йрепаратов,содержащих активную ДНК - 41. В то жевремя, анадогичная обработка нуклеазой препаратов, не обработанных глутаровым альдегидом, приводит к отщеплению 65 нуклеотидного материала. Препараты иммобилиэованных нуклеиновых кислот на АЭ-целлюлозестабильны в, течение года при многократном использовании и хранении.Использование иммобилиэованной Днк вкачестве сорбента для хроматографиисредства терминальной деэоксинуклеотидилтрансфераэы из тимуса позволяетпровести очистку фермента по белкув 3-5 раз с выходом активности 6075, очистку от, нуклеаз в 15-30 раз,очистку от фосфодиэстераз в 50200 раз.П р и м е р 125 мл водногораствора денатурированной ДНК илиРНК с концентрацией 10 мг/мл(200 об. е,/мл, измеренные при260 нм на приборе СФ), погружают .в воду, имеющую температуру кипящейводяной бани, на 10 мин и всыпаютв нее 10 г влажной АЭ-целлюлозы(4 г сухого веса). Смесь выдерживают,в течение 15 мин на кипящей водяной бане при постоянном перемеииваиии.Затем добавляют 6 мл 3-ного водного раствора глутарового альдегидадо концентрации его в реакционнойсмеси 0,5 об. и инкубируют смесьеще в течение 10 мин на кипящейводяной "бане. Полученный осадок,представляющий собой иммобилиэованную нуклеиновую кислоту (ДНК илиРНК), переносят на стеклянный порис 10 тый Фильтр, промывают водным раствором 1 М ИвС 1 до отсутствия оптической плотности ДНК в промывных водах и водой,Связывание нуклеиновых кйслот с15 АЭ-целлюлозой 80-90, содержаниенуклеиновых кислот 50-60 мг/г матрицы.Иммобилиэованная РНК стабильнав условиях хроматографии ферментныхпрепаратов, содержащих нуклеазы.При исчерпывающем гидролизе эндонуклеаэой Веггай 1 а шегсесвсеав (20 чпри 37 С) от матрицы отщепляетсяне. более 18 нуклеотидного материала, связанного с матрицей. Препараты стабильны в течение года прийериодическом использовании и хранении при 4 С.П р и м е р 2. Иммобилизациюнуклеиновых кислот проводят как вЗ 0 примере 1, за исключением того,что для иьзлобилиэации берут 50 млводного раствора денатурированнойнуклеиновой кислоты и инкубируют с:АЭ-целлюлозой в течение 30 мин. ПриЗ 5 этом получают препараты иьвюбилизованных нуклеиновых кислот (ДНК илиРНК) с содержанием ДНК или РНК 100120 мг/г матрицы,П р и м е р 3. Иммобилизация40 нативной ДНК,К 2 г влажной АЭ-целлюлозы (0,66 гсухого веса ) приливают 11 мл раствора ДНК с концентрацией 2,3 мг/мл,Инкубируют смесь в течение 20 мин при45 60 С при непрерывном перемешивании.оЗатем в смесь вливают 1 мл 3 глутарового альдегида до концентрацииего в реакционной смеси 0,25 об,и инкубируют в течение 2 ч при 25 Спри непрерывном перемешивании. Послеокончания выдержки смесь переносятна стеклянный фильтр, промЫвают водным раствором 1 М ИаС 1 до отсутствияоптическойплотности ДНК в элюатеи водой.Получают препарат, содержащий30 мг (ДНК) г сухого веса препарата,Выход по иммобилизации ДНК составил 80. При проведении исчерпывающего гидролиза энденуклеазой от мат 60 рицы отщепляется 40 иммобилизованной ДНК. При аналогичной обработкеобразца, необработанного альдегидои,отцепляют 65 ДНК.П р и м е р 4. ИммобилИзации нук.65 лейновых кислот проводят как в при665635 уедаактор Л. Письман Техред Т.Фанта Корректор Г. Огараюю 4 феююииаававтааайтююютВааававаааееаюеаюттаавеаааюююаатютвттвттиеаваттаи Занаэ 1138/5 Тираж 522 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРцо делам изобретений и открытий113035 Москва, М, Раушская наб., д. 3/4 ававЮюЮююЮтютттюювюттттююттюююааттютеатюююююютюютютт ват Филиал ПЧП фПатентф, г. ужгород, ул, Проектная, 4 мере 1, эа исключением того, что всмесь добавляют 5 мл 25-ного водного" рвасвтвораглутарового альдегида(концентрация глутарового альдегида в реакционной смеси составляет 4,0 об.). Связзеание нуклеиновых кислот с АЭ-целлюлозой 80-90, с- держание нуклеиновых кислот 50 , 60 мг/г. При исчертывающем гидролизе эндонуклеазой Веггас 1 а шагсесвееав от препарата отщепляется не более 20 содержащейся в нем ДНК.