Способ получения лактатоксидазы

.В 577.15(088.8) Патент США 1" 6 01 И 31/14, ппо 1.1., Ьд С., Тзао Т.С. пппоЬ 111 хей Ьас Ьасс 1 с АсЫ Ап Вюепу.п, 1984 4166763,опублик. 1979.Гц СЬеп, Т 11 с 1 сдп 8- Т 1 зе йече 1 оршепг. гае ОхЫазе Бузуев а 1 уз 1 з.-В 1 осесйпо 1.26, р. 167-173 еду ющим ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТпО изОБРетениям и ОтнРытиямПРИ ГКНТ СССР А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛАКТАТОКСИДАЗЫ(57) Изобретение относится к. микробиИзобретение относится к микробиологической промышленности и касаетсяспособа получения фермента лактатоксидазы, превращающей молочную кислоту(пируват) и НО, который может бытьиспользован в аналитических системах,применяемых в медицине, пищевой и микробиолоической промышленности.Цель изобретения - упрощение способа,расширение его функциональныхвозможностей и повышение выхода фермента,Способ осуществляют сл образом.В качестве продуцента используютштамм АсеСоЬасСег зцЬохуяапз чаг.шцсхрагцш РгаСецг Р С 1 В 5595 (1950 -51)4 С 12 М 9/02//(С 12 Х 9/О С 12 Е 1;02) 2ологической промышленности и касается способов получения лактатоксидазы. Цель изобретения - упрощение способа, расширение его функциональных возможностей и повышевие выхода фермента. В качестве продуцирующего микроорганизма применяют штамм.АсеоЪасег зцЬохуйапз чаг шцсхрагцш Ггагецг Ф СХВ 5595 (1950-1280), способный синтезировать лактатоксидазу, окисляющую лактат до пирувата и НО, посевной материал которого выращивают на творожной сыворотке, являющейся дешевым натуральным источником молочной кислоты, Способ позволяет получить лактатоксидазу с активностью 7,75 ед/мл, удельной активностью 1,2 ед/мг белка при выходе /90,5 ед/л,1280). Посевной материал продуцентавыращивают на питательной среде, содержащей молочную кислоту, источником которой служит творожная сыворотка. В ходе сбраживания молока содержащаяся в нем лактоза превращается вмолочную кислоту, которая после отделения сгустков молочных белков, т.е.творога, остается в сыворотке и составляет 0,92-1,24%. Концентрации мо.лочной кислоты в творожной сывороткеменее 0,96% и более 1,24% маловероятны, исходя из режима технологическогопроцесса приготовления творога. Творожная сыворотка является дешевым отходом технологического процесса приготовления творога.Активность полученной лактатоксида з ы опр едел яют сне ктр офотометрич еским методом, исходя из схемы заданного способа превращения молочной кисло 5ты: молочная кислота + Олактатокси - пировиноградная кислота + НО.дазаМетод включает взаимодействие лактатоксидазы с субстратом - Ь-молочной 10кислотой в цитрал-Фосфатном буфере,рН 6,5, и детектирование образовавшейся Н О пероксидазой, что визуализируется присутствием в реакционнойсмеси о-фенилендиамина, Единицу ак-,тивности лактатоксидазы выражают количеством фермента, превращающего1 мкмоль молочной кислоты в пировиноградную кислоту и Н Опри рН 6,5,.25 С в течение 1 мин..о20Способ поясняется следующими примерами,И р и м е р 1 (контроль) . Способвключает следующие этапы: поддерживание культурыв пробирках, выращивание 25посевного материала в колбах и культивирование микроорганизма в колбахв присутствии молочной кислоты, отделение биомассы, разрушение клеток,центрифугирование их гомогената с целью получения растворимого Ферментасыр ца,Поддерживание .культуры АсесоЪассесзцЬохуйапв час. шцс 1 расцш Ргасецг19 50-1289,35Культура поддерживается в пробирках на скошенном агаре и в колбах сжидкой питательной средой переменно.Состав агаризованной среды следующий,г/л: дрожжевой экстракт 10, глюкоза10; пептон 5; мел 10, агар 15. Источники углерода - глюкоза, сорбит, глицерин, периодически меняют. Жидкиесреды для поддерживания культуры представляют собой питательные среды, применяемые для выращивания посевногоматериала, состав которых приводитсяниже, На скошенном агаре культура сохраняется в течение 1 мес, а в жидкихсредах - 2-3 сут.Выращивание посевного материала икультивирование продуцента в колбах.Бактерии со скошенного агара пере-,сеивают в колбы с питательной средой,состав которой соответствует указанному в прототипе: 10 г/л 85/-ной Э,Ь-молочйой кислоты; 5,0 г/л дрожжевого экстракта; 2,0 г/л КНРО ЗНО;2,0 г(л МяБО; 7 НО,. 500 мл пивного сусла, 500 мл фталатного буфера, рН 5,5. Посевной материал выращивают втечение 1 сут при 25 С на качалкепри 150 колебаний/мин,Посевной материал в количестве 5%переносят в колбы с ферментационнойсредой, состав которой соответствуетуказанному в прототипе, г/л: ЮН 4 С 11,5;,дрожжевой экстракт 1,0; На 805,0; КНРО 4 4,0 М 8804 7 НО Оф,Мп 80 НО 0,08; 37,5 мп/л 407-ной Р, Ь-молочной кислоты, рН среды уравновешивают с ИН ОН до 5,2. Культивирование продуцента проводят в течение 24 ч при 25 С на качалке при 150 колебаний/мин.Отделение биомассы, ее гомогенизация и центрифугирование клеточного гомогената,Биомассу отделяют центрифугированием 3000 об/мин в течение 30 мин,Выход биомассы составляет 12 г/л питательной среды, т,е, 2,4 г сухой массы/л из расчета, что сухое вещество клетки составляет около 20 Х.Клетки 3-кратно промывают цитратфосфатным буфером, рН 6,5, суспендируют в этом же буфере в соотношении 1:3 и обрабатывают ультразвуком частотой 22 кГц в течение 6 мин, Клеточный гомогенат центрифугируют при 100000 в течение 3,5 ч при 4 С, Супернатант представляет собой фермент-сырец,лактатоксидазная активность которогодостигает 6 100 ед/л (6, 1 ед,(мп).Концентрация белка 6,0 мг/мл, т.е. активность 1 мл фермента в пересчете всоотношении с количеством белка вэтом же объеме 1 ед/мл. Выход фермента-сырца в пересчете на 1 л питательной среды (масса биомассы умноженнаяна объем буфера, в котором она суспендируется, и на активность 1 мпфермента-сырца) 219,6 ед,П р и м е р 2, Культивированиепродуцента с применением творожнойсыворотки в качестве источника молочной кислоты для выращивания посевного материала,Поддерживание культуры АсесоЬаесесзцЬохуйапз ас. шцсхрасцш Ггасецс.1950-1280 проводят по примеру 1. Посевной материал выращивают в колбахна питательной среде, приготовленнойна основе творожной сыворотки, содержащей 0,96 молочной кислоты, с до-, бавкой 5,0 г/л дрожжевого экстракта, рН питательной среды 5,2. Творожную1521774 6Выход биомассысоставляет 32 г/лпитательной среды (в пересчете насухую массу 6,4 г/л) . Активность полученного образца лактатоксидазы составляет 7700 ед./л, т,е. 7,7 ед./мн.Выход фермента в пересчете на 1 лпитательной среды 739,2 ед.Преимуществом способа является упрощение получения лактатоксидазы,превращающей молочную кислоту в пировиноградную кислоту и Н 0,2 при применении доступного микроорганизма ипростой питательной среды. Составитель Е, Воробьева Техред Л.Олийнык Корректор С, Черни Редактор Н. Киштулинец Заказ 6892/24 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул . Гагарина,10 сыворотку подщелачивают до рН 5 2У Фавтоклавируют при 0,5 атм в течение303 мин и хранят при 4 С. Перед примонением дважды фильтруют через бумажный фильтр,Далее выращивание посевного материала и культивирование продуцентапроводят по примеру 1. Выход биомассы составляет 34 г/л питательной среды (в пересчете на сухую массуб,8 г/л).Получение фермента-сырца проводяпо примеру 1, Активность полученнЬгобразца лактатоксидазы составляет7750 ед/л, т.е. 7,8 ед./мл. Концентрация белка ,б мг/мп, т.е, активность1 мл фермента в пересчете в соотношении с количеством белка в этом жеобъеме 1,2 ед/мг. Выход фермента в 20пересчете на 1 л питательной среды790, 5 ед.П р и м е р 3Поддержание культуры АсесоЬасгег охуЙапз айаг. шцсхрагцш Тгаецг 1950-1280 проводят по приме ру 1.Посевной материал выращивают в кол 1бах на питательной среде, приготовленной на основе творожной сыворотки,содержащей 0,9 бХ молочной кислоты, сдобавкой 7 мл/л 40%-ной молочной кислаты (суммарная концентрация 1,247)и 5,0 г/л дрожжевого зкстракта,рНпитательной среды 5,2.5/ (5 мл) инокулята переносят вферментативную среду, и процесс далее 35проводят по примеру 1,Формула изобретенияСпособ получения лактатоксидазы,предусматривающий выращивание посевного материала продуцента из рода АсесоЪассег на питательной среде, содержащей источник молочной кислоты идрожжевой экстракт, внесение инокуля. -та посевного материала в ферментаци-,онную среду и культивирование до максимального накопления фермента, отделение биомассы, ее гомогенизацию ицентрифугирование, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, расширения его функциональных возможностей и повышения выхода фермента, в качестве продуцентаиспользуют штамм АсесоЬассег зцЬохудапз айаг шцс 1 рагцп Егагецг ХС 1 В 5595,а в качестве основы питательной среды и источника молочной кислоты длявыращивания посевного материала используют творожную сыворотку,