Способ определения активности супероксиддисмутазы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИК 21773 19) 8 51)4 С 12 М 9/02, С 12 Я 1/00//С 33/573 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ зобретениемедицине и в био химич 57)ии относится к биоло может быть исполь еских и клиническ также для контрол зован ледованиях,ГЗЭСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГННТ СССР А ВТОРСНОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТ(56) Авторское свидетельство СССРФ 855502, кл. С 12 И 9/02, 1981.ВеапсЬащр С., РгЫоч 1 сЬ Л, Апа 1ВхосЬещ. 1971, ч.44, р.276-287,(54 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИСУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в биохимических и клинических исследованиях, а также для контроля технологического процесса получения препарата супероксиддисмутазы (СОД) в микробиологической промышленности.Цель изобретения - повьппение специфичности и чувствительности определения и удешевление способа.На фиг. 1 показано изменение спектра кверцетина в процессе его окисления (1- исходный спектр; 2,3,4,5- спектр после 5, 10, 15 и 20 мин окисления);.на фиг. 2 - зависимость степени торможения реакции автоокисления кверцетина от концентрации СОД; на технологического процесса получения препарата супероксиддисмутазы (СОД) в микробиологической промышленности. Целью изобретения является повышение специфичности и чувствительности определенияудешевление способа.Для определения активности СОД используют вновь установленную реакцию автоокисления флавоноида растительного происхождения - кверцетина в присутствии тетраметилэтилендиамин при оптимальном соотношении концентр ций реагентов; 0,8 мМ тетраметилэтилендиамин в 0,015 М фосфатном буфере при конечномрН 10 и 0,08 мМ этилендиаминтетраацетат. Реакцию характеризуют величиной изменения оптической плотности при 406 нм за 20 мин.3 табл., б ил. Сл фиг. 3 - зависимость скорости окисления кверцетина от рН; на фиг, 4 - зависимость скорости окисления кверцетина от концентрации фосфатного буфера; на фиг. 5 - зависимость скорости окисления кверцетина от концентрации тет" Сфф раметилэтилендиамина (ТМЭДА); на Фиг. 6 " зависимость скорости окисления кверцетина от времени инкубации.Способ заключается в том, что для определения активности СОД используют ,Вфф вновь установленную реакцию автоокисления Флавоноида растительного происхождения - кверцетина в присутствии тетраметилэтилевдиамина, К 2,5 мл 0,02 М фосфатного буфера, рН 7,8, добавляют 0,5 мл 0,005 М раствора ТМЭДА,1521773 7, торможенияЮщ опытная пробах 100,даос контрольная проба Опыт Опытнаяпроба Контрольная Холостаяпроба проба 0,07 0,07 0,07 1 0,05 2 0,05 3 . 005 0,08 0,08 0,08 Х торможения == 25/. приготовленного на 0,5 мМ растворе ЭДТА, и 0,1 мл 0,5 мМ раствора кверцетина. Установлено, что в этом случае имеет место зависящее от анион 5 радикала кислорода окисление молеку" лы кверцетина, сопровождающееся увеличением максимума поглощения в области 335 нм и исчезновением в области 406 нм (Фиг. 1). Ловушка синглетного кислорода - азид натрия (6 Степень торможения реакции окисления кверцетина,зависит от концентрации добавленной СОД и эта зависимостьпредставляет собой монотонно возрастающую кривую, представленную нафиг. 2. о этой кривой определена величина 1 0, соответствующая количеству фермента, ингибирующего реакциюавтоокнсления кверцетина на 50 , иравная 1,4 нг/мл .На основании сравнения величин 1 25можно утверждать, что данный способпримерно в 6 раз чувствительнее прототипа и в 35 раз чувствительнееспособа, основанного на реакции автоокисления адреналина. ЗОАктивность Фермента сохраняетсяпостоянной в интервале рН от 4,8 до10, Максимальная скорость процессаимеет место при максимальном значенииоптимума рН анализируемого фермента,т,е. рН 10 (Фиг. 3), концентрациифосфатного буфера 0,015 М (фиг. 4) иконцентрации тетраметилэтилендиамина(ТМЭДА), равной 0,8 мМ (Фиг, 5), Максимальное время, соответствующее линейному участку зависимости количестваокисленного продукта от времени реакции 20 мин (Фиг. 5,6) максимальныеспектральные изменения, отражающиепроцесс окисления кверцетина, наблюдают при длине волны ДВ 406 нм (см.фиг. 1),П р и м е р 1. К стандартной инкубационной среде, содержащей 2,5 мп0,02 М Фосфатного буфера, рН 7,8, и0,5 мл 0,005 М ТМЭДА, приготовленного на 0,5 мМ. растворе ЭДНА, добавляют0,2 мл синовиальной жидкости, разведенной в 10 раэ, и 0,1 мл 0,5 мМ рас- .твора кверцетина в диметилсульфоксидеопытная проба; 0,2 мл синовиальнойжидкости, разведенной в 10 раз и выдержанной в кипящей водяной бане10 мин, и 0,1 мл 0,5 мМ раствора квер 60 ьИ), каталаза (0,01-100 мкгlмл) не оказывают влияние на этот процесс. В то же время очищенный препарат СОД с удельной активностью 3000 Б/кг его ингибирует. Степень ингибирования оценивается по отношению величины изменения оптической плотности при 406 нм ( Л 1)щ ) в присутствии СОДд 114 фб в контрольной пробе, не содержащей фермента за 20 мин,цетина - контрольная проба;,0,2 мпфизиологического раствора и О, 1 мл0,5 мМ раствора кверцетина - холостаяпроба,Оптическую плотность при 406 нмопределяют сразу после добавлениякверцетина и через 20 мин. Результатыприведены в табл. 1. Т а б л и ц а,1 Результаты трех параллельных определений активности СОД в синовиальной жидкости больного ревматоидным артритом Изменение оптической плотностипри 406 нм за 20 мин (Ю) Процент торможения реакции окисления кверцетина под действием экзогенной супероксиддисмутазы вычисляют по уравнению ьЭщ контрольная - ь 040 ь опытнаях 1003ЮВ 06 холостая40 07-0 05Ж торможения = - ---- х 100% =0,08 Из графика, приведенного на фиг.2 определяют количество СОД в пробе: СОД = 0,5 нг/мл.Содержание СОД в синовиальной жидкости рассчитывают, учитывая ее разведение: СОД = 0,5 нг 3,350 = = 82,5 нг/мл синовиальной жидкости.5 152П р и м е р 2. К стандартной инкубационной среде, содержащей 2,5 мп 0,02 М фосфатног о буфера, рН 7,8, и 0,5 мп О, 005 М ТМЭДА, приготовленного на 0,5 мМ растворе ЭДТА (конечный рН составного буфера 10), добавляли 0,1 мл крови, полученной из пальца пациента и разведенной в 600 раз дистиллированной водой, и О, 1 мп 0,5 мМ раствора кверцетина в диметилформамиде - опытная проба; 0,1 мл крови, разведенной в 600 раз и выдержанной в кипящей водяной бане 1 О мин, и 0,1 мл 0,5 мМ раствора кверцетина контрольная проба; 0,1 мп дистиллированной воды и О, 1 мл 0,5 мМ раствора кверцетина - холостая проба, Анализ проводили как и в случае примера 1. Результаты приведены в табл, 2. Таблица 2Результаты трех параллельных определений активности СОД в крови человека17736кверцетина - холостая проба. Результаты приведены н табл, 3. Таблица 3 Результаты трех параллельных опре- делений активности СОД в гомогенате печени крыс Изменение ойтической плотностипри 406 нм за 20 мин (йЛ) Опыт 1 0,06 0,08 0,08 2 0,06 0,08 0,08 3 0,06 0,08 0,08 20Расчеты ниполняют аналогично примеру 2. 0,08-0 06Из графика, приведенного на фиг,2,определяют количество СОД в пробе:СОД = 0,05 нг/мл.30 Содержание на 1 г печени: СОД =- 0,53,2 " 50000 = 80 мкг /г ткани .П р и м е р 4. Способ реализуют внаборе реактивов, состоящем из 4 флаконов и рассчитанном на 100 определе 35Флакон А из темного стекла, объем15 мл содержит 1,5 мг кверцетина,Флакон Б содержит 10 мл диметилсульфоксида,Флакон В, объем 75 мп, содержитОт 35 ТМЭДА,Флакон Г содержит 50 мп 0,5 мМ раствора ЭДТА. 0,02 М фосфатный буФер,рН 7,8, приготавливают отдельно.Для проведения анализа содержимоефлаконов Б и Г приливают соответственно во флаконы А и В, растворы перемешивают и выдерживают 2 ч, послечего используют для проведения анали 50 .за в соответствии с описанием, приведенным в примере, После смешивания реактивы могут быть использованы в течение 2 сут,1 0,04 2 0,04 3 0,04 0,08 008 0,08 0,08 0,08 0,08- 50/ Из графитка, приведенного на фиг.2, определяют количество СОД в пробе: СОД = 1,4 нг/мп.Содержание СОД в крови рассчитывают, учитывая выполнение разведения: СОД = 1,4 3,2 6000 = 26,8 мкг/мл. Опьп Изменение оптической плотности при 406 нм за 20 мин ,д 1 З)Опытная Контрольная Холостаяпроба проба проба 0 08-0 04торможения = д -д -- х 100/0,08 П р и м е р 3. К стаццартной инкубационной среде добавляют О, 1 мл раз.веденного в 500 раз 1 О/ гомогената печени и О, 1 мп 0,5 мМ раствора кверцетина в диметилформамиде - опытная проба; О, 1 мп разведенного в 500 раз 10% гомогената печени, выдержанного в кипящей водяной бане 10 мин, и О, 1 мп 0,5 мМ раствора кверцетина контрольная, проба; О, 1 мл дистиллированной воды и 0,1 мп 0,5 мМ раствора Формула изобретенияСпособ определения активности супероксидцисмутазы, предусматривающий оценку степени торможения реакции окисления субстрата анион-раггпкдломкислорода в присутствии тетраметилэтилендиамина (ТИЭДЛ) пь иэменениювеличины оптической плотности в реакционной смеси, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения специфичности и чувствительности определения,а также удешевления способа, вкачестве субстрата окисления используют кверцетин, реакцию проводят в течение 20 мин при рН 1 О в 0,015 И фосфатном буфере в присутствии 0,8 ьИ 5ТИЭдА, в реакционную смесь дополнительно вносят 0,08 мМ этилендиамин"тетраацетат, а величину оптическойплотности определяют при длине волны406 нм.1521 773 иРЗ р ТМЯДМ ь Е. Воробьеваийнык Корректор С. Че актор Н. Киштулине Тираж 501митета по изобретенсква, Ж, Раушска наб., д 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. ужгород, ул. Гагарина, 10 аказ 6892/24 НИИПИ Государственного 113035, ставит хред Л,Р ЗО ЯОг. Р Подписноем и открытиям при ГКНТ СССР