Способ определения концентрации аминогликозидного антибиотика

(57) Изонологии аСояг. йаС 11 о 1.,197 ОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ 4064921/28-1329,04,8623.03.88, Бюл. У 11Государственный научно-исследоьский институт по стандартиза контролю лекарственных средств С.П,Катруха, Н.С.Евтушенко .Кудрявцева615.9.90(088.8)3, СМп,селеш, 25/7, 1979, 2-1225. Б ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЛИКОЗИДНОГО АН ТИБИОТИКАетение относится.к биотехможет быть использовано ЯО 13828 для качественной и количественной характеристик стандартов, субстанций и лекарственных форм аминогликозидных антибиотиков. Цель изобретения- повышение точности способа, которая достигается тем, что раствор антибио тика основания смешивают в соотношении 1:4 с раствором фенилизотиоцианатом (ФИТЦ) в ацетонитриле, реакционную пробу инкубируют при 68-72 С в течение 10-,12 мин. После охлаждения до комнатной температуры полученное фенилкарбонильное производное хроматографируют на силикагеле с обращенной фазой С , а элюцию проводят в зависимости от времени от начала элюции возрастающей концентра ции с 53 до 987. ацетонитрила в фосфатном буфере рН 6,9.Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для качественной и количественной характеристик стандартов, субстанций и ле карственных форм аминогликозидных антибиотиков, в том числе для обнаружения в исследуемых образцах приме-.сей известнойи неизвестнойструктуры.10Целью изобретения является повышение точности способа.П р и м е р 1. К 50 мкл рабочего ,раствора канамицина А основания добав ляют 200 мкл раствора фенилизотиоциа ната (ФИТЦ) в ацетонитриле (50 мкл ФИТЦ в 1 мл ацетонитрила) и пробу ин ;кубируют при 70 С в течение 10 мин. После охлаждения до комнатной температурыы к реакционной смеси добавляют 20 750 мкл 507.-ного ацетонитрила и алик: воту наносят на колонку хроматографа,4,6 х 250 мм, заполненную 2 огпах ОБО,,5 мкм. В течение первых 4 мин элюцию . ведут подвижной фазой, состоящей 25 из 53 Ж ацетонитрила и 472 0,03 М фос" , фатного буфера рН 6,9. Начиная с 5по 10 мин, концентрацию ацетонитрила в подвижной фазе увеличивают до 987 Скорость элюции 1 мл/мин, петля в 30 инжекторе 10 мкл, детектирование производных фенилтиокарбонила (ФТК) осуществляют с помощью ультрафиолетового детектора при 254 нм, скорость ленты на самописце 0,5 см/мин. Обработку хроматографических данньх проводят по площадям пиков. За 10 мин при 70 С происходит практически количественная модификация всех аминогрупп антибиотика (в канамицине А четыре 40 аминогруппы). Это положение подтверждается наличием на хроматограмме незначительных пиков, соответствующих продуктам частичного замещения(с временами выхода между 2,57 и 45 3,12 мин). Суммарная площадь этих пиков составляет менее 1,97. Площадь пика полностью замещенного производного (время выхода 3,60 мин) составляет 119, т.е. достигается мак симальное значение. П р и м е р 2. К 50 мкл раствора тобрамицина основания концентрацией 5 мг/мл добавляют раствор ФИТЦ, и модификацию и хроматографию ФТК-производного антибиотика проводят так же, как описано для канамицина А в примере 1, В контрольном опыте раствор тобрамицина заменяют дистиллированной водойВ аналитическом опыте по сравнению с контрольным на хроматограмме получают только один пик производного ФТК со временем выхода 8,59 мин, что свидетельствует а 1007.-ной модификации всех пяти аминогрупп антибиотика. При калибровке прибора установлена линейная зависимость между площадями пиков на хроматограмме и концентрацией антибиотика в растворах в пределах концентраций 0,1-5 мг/мл.П р и м е р 3. Показана принципиальная возможность определения си-: зомицина и гентамицина в лекарственных формах и стандартах. Растворы сизомицина сульфата и гентамицина концентрацией 5 мг/мл обрабатывают таким же образом, как и канамицин А,1 Время выхода ФТК-сизомицина 11,73 мин. В случае гентамицина на хроматограмме обнаруживают три пика с временами выхода 11,24, 11,69 и 12,35 мин. Пик 11,24 мин неоднородный, с раздвоением, что указывает на присутствие двух ФТКпроизводных. Полученная картина раздепения ФТК-гентамицина свидетельствует об обнаружении в нем четырех веществ, что согласуется с известным положением, что препарат гентамицина состоит из четырех компонентов - С, Ср С 2С афПредлагаемый способ определения аминогликозидных антибиотиков прост и не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, Выполнение анализов занимает не более 45 мин, Метод позволяет проводить качественный и количественный анализы основного компонента лекарственной формы, определять наличие примесей и идентифицировать отдельные компоненты сложных лекарственных форм.Формула изобретенияСпособ определения концентрации аминогликозидного антибиотика путем модификации основания антибиотика по аминогруппам с последующим разделением полученного производного на колонке с обращенной фазой методом жидкостной хроматографии, элюции смесью ацетонитрила и фосфатносолевого буфера и определения концентрации антибиотика, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности1382849 Составитель С.ЛиствиноваТехред Л.Олийнык Корректор И.Зрдейи Редактор Н,Гунько Тираж 520 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д,4/5Рф Заказ 1263/22. Производственно"полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная,4. способа, основание антибиотика модифицируют в соотношении 1:4 по объемуфенилизотиоцианатом в среде ацетонитрил - вода при 68-72 С в течение10-12 мин, разделение полученногофенилкарбонильного производного антибиотика проводят на силикагеле с обращенной фазой С д а элюцию проводят при нейтральном значении рН, приэтом концентрацию ацетонитрила вэлюирующей смеси повышают с 4 до10 мин с 53 до 982.