Способ определения ферментов, обладающих амидазной активностью

(11)г О 1/ОО САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ УСВИДЕТЕЛЬСТ ТОРС но енетикиицинский улярной г вский мед ченоваВ,Н.Незавиб .Д.Большакова Смоляницкий ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫ(71) Институт молеАН СССР и 1-й Москинститут им. И.М.С(57) Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к способам анализа ферментов, гидролизующихамидные связи. Дель - повышение чувствительности способа определения.Способ заключается в том, что для определения амидазной активности ферментов к термостатированному вод му раствору субстрата - 1 -(аминоацил)- -аминонафталин-сульфамида добавляютизвестное количество препарата фермента и полученный раствор инкубируют при постоянной температуре в течение фиксированного интервала времени, после чего добавляют раствор проявителя, содержащий диазоль, например борфторид нитрофенилдиазония,и кислоту, останавливающую действие фермента. Полученный раствор красителя помещают в кювету.спектрофотометра и определяют оптическую плотйость в максимуме поглощения краситепя. По величине оптической плотности рассчитывают количество продукта реакции. ф и далее активность фермента, сравнивая ее со стандартным образцом. 1 табл.113Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к способаманализа ферментов, гидролизующихамидные связи,Цель изобретения - повышение чувствительности способа.Способ заключается в расщеплениипод действием определяемого ферментааминоациламино-нафталинсульфамидови спектрометрическом определенииобразующихся амино-нафталинсульфамидов цветной реакцией с солями арилдиазония, например 4-сульфофенилдиазония или 4-нитрофенилдиазония.Для определения амидазной активности ферментов по предлагаемому способу к термостатированному водномураствору субстрата-(аминоацил) --аминонафталин-сульфамида, содержащему компоненты, необходимые для нормального функционирования фермента(например, соли, поддерживающие оптимальное значение рН), добавляют известное количество препарата,фесмента, Полученный раствор инкубируютпри постоянной температуре в течениефиксированного интервала времени,после чего добавляют раствор проявителя, содержащий диазоль, напримерборфторид нитрофенилдиазония, и кислоту, останавливающую действие фермента. Полученный раствор красителяпомещают в кювету спектрофотометраи определяют оптическую плотность,предпочтительно, в максимуме поглощения красителя, используя в качествераствора сравнения аналогичный посоставу раствор, в который ферментбыл добавлен лишь после добавленияпроявителя. По величине оптическойплотности рассчитывают количествопродукта реакции и далее активностьфермента, сравнивая ее со стандартным образцом.П р и м е р 1. Определение активности трипсина с использованием53809 2 метиленсульфамида в 0,1 М трис-НС 11 буфере рН 7,8.Раствор 2. 1 мМ борфторида нитроб фенилдиазония в 0 9 М уксусной кислоУ те.К 1 мл термостатированного при 25 С раствора 1 добавляют 10 мкл раствора фермента, перемешивают ВСтря 1 О .хиванием, инкубируют 20 мин, добавляют 1 мл раствора 2, через 5 мин определяют оптическую плотность при 500 нм, используя в качестве раствора сравнения инкубировавшуюся смесь 15 1 мл раствора 1 и 1 мл раствора 2, в которую фермент добавляют после приготовления смеси. Содержание фермента определяют иэ отношения оптических плотностей анализируемого и стандартного растворов.Аналогичным образом могут быть определены амидазные активности других ферментов,Результаты опытов приведены в 25 таблице.Использование изобретения позволит повысить чувствительность определения амидаэной активности ферментов, что особенно важно при проведении э 0 клинико-лабораторных исследований. Формула изобретенияСпособ определения ферментов,обладающих амидазной активностью, предусматривающий проведение ферментативной реакции гидролиза аминоацильного производного соединения нафталинового ряда, азосочетание продукта реакции с солью диазония 4 О с последуюей регистрацией поглощения света, о т л н ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве субстратов ферментов используют 1-(ами ноацил)-аминонафталин-сульфамидыобщей формулы ьО де К - аминоацил, ациламиноаци ентиди ульфамигруппа,гъй ох 1хс1 г ИО 161 ЛхО Хк хФ Яо ао хо оО, Х х юОа х3Ф х эЙ г Х цачхое ох1ОхОс ЭМВ Фоц 1 ф лохо аЧих1 3айодфоо ам Ч о г 4 ф х 1 а