Способ получения иммобилизованных ферментов

(19) (11) д) С 12 14 11/08 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Таллинский политехнический институт и Специальное конструкторско-технологическое бюро биологически активных веществ(56) 1. Авторское свидетельство СССРпо заявке 9 2429389/28-04,кл, С 07 6/02, 1976 н/п (прототип).(54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ путем совместной полимеризации акрильных мономеров в растворе фермента в присутствии глутарового альдегида и инициаторов полимеризации,о т л и ч а ющ и й с я тем,что, с целью повышения активности и стабильности целевых продуктов, в полимеризационную смесь добавляют диизоцианат винной кислоты в количестве 0,25-0,5, гексаметилендиамин в количестве 0,25-0,4 и сахарозу в количестве 20-30 от веса полимеризационной смеси и процесс ведут при 5-10 С.2, Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я, тем, что используют глутаровый альдегид в количестве 0,5-1 от веса полимеризационной смеси.3. Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве ини- Я циаторов полимеризации используют Х,Х,Х,)-тетраметилэтилендиамин и надсернокислый аммоний.510 15 2 О 25 ЗО )5 лО 45 50 6 О Изобретение относится к микробиологической к химической промышленности, в частности к способамполучения иммобилиэованных ферментов, которые могут найти применениепри получении биохимических реактивов, используемых в молекулярнойбиологиии генной инженерии.Известен способ получения иммобилизованных ферментов, заключающийся в полимеризации акрильных мономеров в растворе фермента в присутствии глутарового альдегида и инициаторов полимериэации, причем вреакционную смесь добавляют порошкообразный поликарбамид в количестве 5-10 с содержанием аминогрупп0,3-0,7 миллиэквивалентов на граммвещества и процесс ведут при комнатной температуре Г 13 .Однако указанный способ не обеспечивает достаточно высокой абсолютной и относительной активностии стабильности получаемого продукта(ь частности иммобклизованную транс-И-дезоксиркбозкллазу получают сабсолютной активностью не более30 ед/г и коэффициентом сохраненияактивности не более 0,1, а после5 дней хранения активность иммобилизовайного Фермента не превышает 20) .Целью изобретения является повышение активности к стабильностииммобилизованного Фермента,Указанная цель достигается тем,что в известном способе в полимеризационную смесь добавляют диизоцианат винной кислоты в количестве0,25-0,5, гексаггетилендиамкн в количестве 0,25-0,4 и сахарозу в колггчестве 20-30 от веса полимеркзацР 10 нной смеси и прОцесс полиг.ериза"1 гии Ведут пои 5"10 С.При осуществлении способа глутаровый альдРт.ид испОл 1 ззуют в количестве 0,5 -1 от вес= полкмеризац"ганной смеси, а г, качестве инициаторов.)/полимеризации - М,И,г,3-тетраметилЭтИЛЕНдиаМИН И НадСЕрВОККСЛЫй Р 11 г.гоний.П р и м е р 1. Для полу:Рнкяпрепарата кммобилизоваггнОЙ транс-И-дезоксирибозилазы (КФ 24,2,8)приготовляют следующие растворы,"1-ный раствор фермента в дистиллированной воде с активностью8,000 ед,акт./мл (за едкни;1 у ;:;.;тквности принимается количество Фермента,.катализирующее превращение1 нмоль субстрата за 1;гин прг37 С); 50-ный раствор мономеровв дистиллированной воде, в которомсодержится 19 вес.ч. акриламкдаи 1 вес.ч, Ы Х-метиленбис акриламида50-ный раствор сахарозы в дксткллированной воде; 50-ный раствор мономеров в 50-ной сахароэе с содержанием 19 вес.ч. акриламидаФи 1 вес.ч. И,Ы-метиленбис-экриламида 10-ный раствор гексаметилендиамина (ГММА) в дистиллированной воде; 10-ный раствор диизоцианата винной кислоты (ДИЦВК) в дистиллированной воде; 10-ный раствор надсернокислого аммония (НСА) в дистиллированной воде; 10-ньгй раствор И,И,И,Х-тетраметилэтилендиамина (ТЕМЕД) в дистиллированной воде. В охлаждаемом сосуде смешивают0,3 мл раствора фермента, 0,3 мл50-ного раствора сахарозы 1,5 млраствора мономеров в 50-ной сахарозе, 0,12 мл 10-ного раствораГМДА, 0,08 мл 25-ного раствораглутарового альдегида (ГА) (фирма"Мерк", ФРГ), 0,13 мл 13-ногораствора ДИЦВК, 0,23 мл 10-ногораствора ТЕМЕД, 0,23 мл 10-ногораствора НСА. Конечные концентрации реагентов в полимеризационнойсмеси следующие,%: мономеры 25,сахароза 30, ГМДА 0,4, ГА 0,7,ДИЦВК 0,4, НСА 0,75, ТЕМЕД 0,75,Фермент 0,1. Температура полимеризационной смеси не должна превышать +5-10 С.Полученную смесь тщательно перешивают к выдерживают в течение30-60 сек до образования геля.06 разовавшийся блок геля измельчаютдо размера гранул 0,3-0,5 мл иОпределяют его активность по общепринятой для данного фермента методике, Получают 4 г препарата с активностью 70 ед.акт./г вл,геля,чтосоставляет 41 от исходной активности, Полученный гель - фермент выдерживают при 4 С в течение 5 сутв буфере и повторно определяют егоактивность, которая оказываетсяравной 210 ед.акт./г вл, геля, чтосоставляет 78 От исходной активности гголученного геля,Полученные результаты показывают,что данный состав геля Обеспечивает достаточную ак квность и,стабильИОсть препарата :.124 обилизованнойтранс в .",-дезоксирггбозилазы,П р : м е р 2, ИммобилкзациюФермента проводят так, как зто описано в примере 1, с использованиемтех же исходных растворов с изменением количества отдельных реагентов. В табл.1 приведены конечныеконцентрации компонентов полимеризационкой смеси и результаты полученные при определения активностиПри- мер Активность фермента ДИЦВК НСА ГАсохр. ТЕМЕД моно- саха- меры розы исходногоГед.акт) иммоб.(ед.акт) 0,4 0,7 0,4 0,75 0,75 2,700 1,100 41 840 (78; 0м 0,5 0,25 0,251,5 - 0,25 0,25 2,700 0 2,700 362 13,4 272 (75) 0,5 0,25 0,25 2,700 о 0,5 1,5 - 0,75 0,75 2,700 135 (21) 0,25 - 0,25 0,75 0,75 1,550 644 43 0,5 0,5 0,75 0,75 2,700 45 1,7 0,25 0,5 0,25 0,75 0,75 2,500 1,000 40 930 (93) 716 (77) 2,400 9300 39 0,5 1,0 0,5 0,750,25 1,5 0,75 0,5 0,750,5 2,200 780 36 523 (67) 2,200 780 36 530 (68) 0,25 1,5 0,25 0,5 0,5 в этих условиях гель не образуетсяФермент вымывания из геля. П р и м е р 3. ИммобилизованныйФерментный препарат, полученныйаналогично примеру 1, применяетсядля получения,дезоксиаденозина изаденина и тимидина. Для этогоферментный препарат добавляютв реакционную смесь, содержащую1,75 нмоль/мл еденина и 8,5 нмоль/млтимидина в цитрат-фосфатном буфере 40 Таблица 2 10 12 16 Номер цикла Начальная скорость, нмоль/мин 2,46 2,61 2,36 2,175 2,6 2,415 2,35 2,6превращениясубстрата за90 мин 65,3 70 68,1 66,6 66 59,6 61 59,8 Данные табл.2 убедительно показывают стабильность и реакционно- способность полученных препаратов.П р и м е р 4. Иммобилизацию Фосфодизстеразы проводят аналогично примеру 1, применяя в качестве 1 25 302 203 20 104 20 105 20б 25 207 20 108 25 209 22,5 2510 25 2 О11 20 30 рН 6,0. Реакцию проводят при постоянном перемешивании при 37 С.После завершения первого цикла использования геля-Фермента, его отделяют от реакционной смеси на фильтре, промывают буфером и используют в следующем цикле.Результаты 16 последовательных циклов описаны в табл.2. 60 раствора Фермента раствор фосфодиэстеразы из змеиного яда с активностью 3000 ед,акт./мл (за.единицу активности принимается такое количество фермента, которое обеспечивает прирост оптической плотностиТехред М,Тенер Редактор Гохфелър Корректор А, Зимокосов Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раущская наб.р д 4/5Заказ 1065/3 Филиал ППП "Патент", г. ужгород ул. Проектная,4 при А щ 400 нм на 0,1 о.е, при гидролизе Са-бис-пара-нитрофенилфосфатаза 30 мин. при 37 фС. Исходное количество фермента 2.400 ед.актконцентрация остальных компонентовполимеризационной смеси,%: мономеры 25, сахароза 20, ГМДА 25,ГА 0,63, ДИЦВК 0,24, НСА 0,75,ТЕМЕД 0,75.При этом получается ферментныйпрепарат с активностью 220 ед,акт./гвлажного геля, суммарная активность - 1,230 ед.акт, что составляет 51 от исходной активности Фермента. При хранении в течение10 дней при 4 С иммобилиэованный 15Фермент полностью сохраняет своюактивность.П р и м е р 5. Иммобилизациюнуклеоэидфосфотрансфераэы из моркови проводят по примеру 1, применяя 20в качестве раствора Фермента растворнуклеоэидфосфотрансферазы иэ моркови с активностью 1100 ед.акт./мл(эа единицу активности принимаетсяколичество фермента, которое обеспечивает образование 1 мкмольнуклеотида из нуклеозида и паранитрофенилфосфата за 1 ч при 3 С врастворе 0,05 М натрия уксуснокислого в 0,18 М растворе калия фосФорнокислого рН 5,2).Исходное количество фермента 550 ед.акт., концентрация остальных компонентовполимериэационной смеси,Ъ: мономеры 25, сахароза 20, ГМДА 0,24,ГА 0,63, ДИЦЕК 0,24,НСА 0,75,ТЕМЕД 0,75. Приэтом получаетсяФерментный препарат с активностью14,7 ед.акт./г влажного геля,суммарная активность 10 ед.акт, чтосоставляет 20 от исходной активности фермента. При хранении в течение 14 дней при 4 С иммобилизованный фермент полностью сохраняетсвою активность.