Индоксиловый эфир n-ацетиллейцина как реагент гистохимического анализа

Союз СоветскихСоциалистическихреспубики ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(51)М. Кл. С 07 О 209/12 С 07 С 101/04 1 Ьвударстввхай квквтвт СььР вф авяви юврвтвквй и вткрьпкй.07 (088,8) Р. Б. Айсина, И. П. Андрианова, И. В, Березин, Е. В. Лукашева,Н, Ф. Казинская и В. В. РыжоваГМосковский ордена Ленина, ордена Трудового Кржтвого Знаьгейй:"и ордена Октябрьской Революции Государственнйй уииверегтеь,.4им. М. В. ЛомоносоваФд 7(54) ИНДОКСИЛОВЫЙ ЭФИР И - АЦЕТИЛЛЕЙЦИНА КАК РЕАГЕНТ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Изобретение относится к получению нового производного индоксила, а именно индоксилового эфира Й-ацетиллейцина, который может найти применение в гистохимическом анализе,Индоксиловые эфиры уксусной и масляной кислот являются субстратами прогеолитических ферментов и широко используются для гистохимических исследований. Принцип .их действия основан на получении окрашенного соединения - индиго, которое образуется при самопроизвольном окислении кислородом воздуха иидоксила, выделяющегося при рас.щеплении эфира ферментом 1 и 2.1 б Однако индоксилацетат и индоксилбутиратне расщепляются трипсином, а в случае химотрипсииа и ряда других протеаз расщепля.ются со скоростью, недостаточной для обес 20печения высокой чувствительности анализа.Известен способ получения индоксилацетатавзаимодействием индоксииа с ангидридом кислоты 3,2Цель изобретения - нолученне нового эфи ра нндоксила, обладающего повышенной расщепляемостью по отношению к протеоли-; тическим ферментам.Для этого к щелочному раствору индоксила в диоксане по каплям при охлаждении реакционной смеси льдом добавляют ангидрид й.ацетиллейцина. Ангидрид М-ацетиллейцина получают известными приемами, напри. мер ацилированием лсйцина избытком уксусного ангидрида. В связи с тем, что свободный иидоксил - нестойкое соединение, легко окис. ляющиеся кислородом воздуха, реакцию проводят в токе аргона,Реакционную смесь нейтрализуют, экстра. гируюг хлороформом, хлороформ удаляют перегонкой, а остаток очищают хроматографически на силикагеле, Выход индоксилового эфира й.ацетиллейцина 30%. Реакция получения иидоксилзвого эфираН-ацетиллейцин может быть .представленаследующей схемой:тСС 0-01-СН - 1ЖОС, СО тью кат с убстрат н трипснн мотрипси 2;10 е гидроли тся Индоксиловый эфир Н.масляной кислоты 2,5 10"Индоксиловый эфир й-ацетиллецина 17,7 Ц-СН - Со 10ЙНСОСйэ Уг ОйИндоксиловый эфир й.ацетиллейцина изу.чен в качестве субстрата ферментов а-химотрипсина и трипсина, Для сравнения его сдругими субстратами исследуют кинетику гидролиэа трех эфиров индоксила - индоксилацетата, индоксилбутират, индоксилацетиллей.цина. Замена остатка уксусной или маслянойкислоты в ацильной части субстрата на остатой ацетнлнрованного лейцина приводит кувеличению константы скорости реакции гид-,ролиза индоксилового эфира в случае а хи.мотрипсина в 810 а раэ, Предлагаемое соедипение расщепляется также с большой скороснод действием трипсина,П р и м е р 1. Получение ангидридай-ацетиллейцииа,К 13,1 г й лейцина прибавляют 25 мл 4 н.йаОН и реакционную смесь охлаждают ледя.ной водой, Затем по каплям одновременнодобавляют 18,9 мл уксусного ангидрида и эф50 мл 4 н, йвОН. После того, как все реа.генты добавлены, реакционную смесь перемешивают 15 мин и подкисляют концентрировзниой НС до рН 1. Выпавший осадокЙ-ацетиллейцнна отфильтровывают, промывают 10 мл ледяной воды и сушат.К 9 г полученного Иацетиллейцина при.бавляют 50 мл (СНэСОО), и перемешиваютна магнитной мешалке до тех пор, пока нерастворится весь й-ацетиллейцин. Уксусный Еанпщрид отгоняют, остзток выдерживают ввакууме масляного насоса в течение 2 ч.Получают 8,5 г вязкого масла, содержащегоангидрид И-ацетиялейцина. Индоксиловый эфир уксусой кислоты 14П р и м е р 2. Получение индоксильного эфира й.ацетиллейцина.К раствору 1,8 г индоксила в 57 млраствора йаОН в токе аргона прибавляют15 мл диоксана, Реакционную смесь охлажДают ледяной водой и в течение ЗО минприбавляют по каплям раствор 8,5 г масла,полученного в 30 мл диоксана. После прибавления всего ангидрида реакционную смесьоставляют на 1 ч при охлаждении ледянойводой. Затем прибавляют 2,8 мл СНэОН в15 мл диоксана и 2,8 мл СНзСООН в 15 млдиоксана. Реакционную смесь упаривзют до.суха, к остатку добавляют 75 мл НО и25 мл хлороформа. Хлороформенные вытяж.ки объединяют, промывают 10 мл воды, су.шат и упаривают. Остаток наносят на колонку с силикагелем н делят в системе бенэол -диоксан 4:1. Вьщеляют 1,1 г (30%) чистогошщоксилового эфира й-ацетнллейцина ст. пл, 141 С,Элементный анализ:Вычислено, %; С 66,65; 66,45, Н 6,99.Найдено, %: С 66,38 - 66,45; Н 6,93 - 6,85. П р и м е р 3. Исследование свойствщщоксиловоо эфира а.ацетиллейцинз.При определении кинетических параметровреакции гидролиза индоксиловых субстратова.химотрипсином до индоксила экспериментпроводят прн рН 8,0 и 25.С 0,2 М йаС 1,0,02 М СаС и 10 об,% ацетона,Концентрация трипсина и а-химотрипсинав ячейке рН-стата 10"з - 6 10" М; над реакционным раствором продувают азот, Концентрации в ячейке иидоксилацетатз 2,50,3 мМ; индоксилбутирата 1,0 - 0,05 мм; ин.доксилзцетиллейцинз 2,5 - 0,6 мМ, Найденныекинетические параметры приведены в таблице,Таким образом, иидоксиловый эфир й-ацетиллейцнна энзчнтельно превосходит приме.няинциеся в гистохимическом знзлизе субстраты-красители по скорости гидролиза ферментами,/30 Тираж 448ВНИИПИ Государственного копо делам изобретений н о 13035, Москва, Ж - 35, Раушская Заказ Подписноета СССРрытий, д. 4/5 ПП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,ак реагент гистохнмнческого анализа. 906991 6Источники ннформаиии,принятые во внимание при экспертизе1, Ьурстон Н.С. Гистохнмня ферментовМ ю 119652, Лиллн Р. Д. Техника и практика гисто.химии и гнстопатологии. М., "Мир", 1967.З,Асуйегюате бег еЬхуайне ие деаа 1 оху 1 а, Вег. (1902), 35, 1701,