Способ определения креатинкиназы мв в сыворотке крови

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 8013369 51) 4 А 61 К 39/О ИТЕТ СССРЙ И ОТКРЫТИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫ ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯПАТЕНТУ 3ГмбХ (ОЕ)Хельмут Ленц,Ральф Линке ЕАТИНКИНАпособу фосфости опв сыво(21) 2891744/28-14(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРЗЫ МВ В СЬ 1 ВОРОТКЕ КРОВИ(57) Изобретение относится к сопределения активности креатинкиназы МВ (СК-МВ) в сыворотке, Цельизобретения - повьппение точноределения креатинкиназы МВ ротке крови. Для этого определяютСК-МВ иммунологическим исключениемгруппы М и измерением группы В по известным методам для определения креатинкиназы. Исключают группы М в реакционной смеси из антител противгруппы М, добавляют одновалентныефрагменты, полученные протеолитнческим расщеплением при восстанавливающих условиях. Фрагменты тормозятне только природными антителами, которые принадлежат к 196-фракции или к-глобулинам и имеют молекулярнуюмассу 130.000-210,000, но и ГАВ-фрагментами, образующимися в результате .протеолитического расщепления изфракции 196 или у-глобулина антисыворотки к креатинкиназе ММ, при этомих предварительно обрабатывают ацетамидом йода. 1 табл.69412 1 133Изобретение относится к способу определения активности креатинфосфокиназы МВ, называемой СК-МВ, в сыворотке.Целью изобретения является повышение точности определения креатинкиназы МВ в сыворотке крови.Способ осуществляется следующим образом.Способ определения .креатинкиназы МВ в сыворотке осуществляется иммунологическим исключением группы М и измерением группы В по известным методам для определения креатинкиназы. Для исключения группы М в реакционной смеси из антител против группы М добавляют одноналентные фрагменты, полученные протеолитическим расщеплением при восстанавливающих услониях.Ферменты тормозятся не только природными антителами, которые принадлежат к 19 С-фракции или к-глобулинам и имеют молекулярную массу около 130,000-210.000, но и ГАВ-фрагментами, образующимися в результате протеолитического расщепления.П р и м е р 1. Получение 196-фрак- ЦИИ еСыворотка овец, которые подвергнуты иммунизации СК-ММ (мьппечный тип фермента ) человека, смешивают с кристаллическим сульфатом аммония при 0-4 С и рН 7 к 1,8 М. После центрифугирования осадок растворяют в 0,1 М ТР 15/0,15 М МаС - буферном растворе, рН 8, и подвергают диализу относительно избыточного количества 10 мМ фосфатного буферного растнора, рН 7,1. Еще раэ осветленный центрифугированием диализат наносят на колонку, которая заполнена ДЕАЕ- целлюлозой. Содержащий протеины поток и элюат, который получается с 15 мМ фосфата /10 мМ йаС - буФерного раствора, рН 7,1, соединяются и содержат более 957. чистой 96 .Расщепление папаином.195 инкубируют при восстанавливающих условиях (10 мМ цистеина ) с 1,57 папаина (мас.7 в пересчете на количество 196-протеина) при рН 7,5 свыше 5 ч при 37 С, В конце фазы инкубации воздействие фермента прекращается избытком ацетамида иода и для алкилирования свободных 5 Н-групп проводят 2 ч инкубацию при рН 7,5 при комнатной температуре. с 1 О 5 20 25 30 35 40 45 50 55 Стабилизированная смесь расщеплениясодержит ГАВ-фрагменты, Г -фрагменты и (107 нерасщепленной 19 С. Выходиммунореакционной способности составляет более 757.Очистка ГАВ-фрагментов,После концентрации до 30 мг/млультрафильтронанием смесь расщепления разделяют методом гель-хроматографии, ГАВ-фрагменты элюируют какпоследний протеиноный пик, хорошоотделенный от 190 и Г, - фрагментов.ГАВ-фракция после концентрированияультрафильтрованием может применяться непосредственно для торможенияСК-ММ или СК-МВ (мозговой тип). Торможение СК-МВ (гибридный тип) составляет в рамках предела погрешности 507. Торможение СК-ММ составляет99-1007П р и м е р 2. Получение фракции-глобулина из плазмы овцы.Цитратную плазму овец, которыеподвергались иммунизации с СК-ММ втечение 4-6 месяцев, разбавляют25 мМ хлористого кальция и ставятприблизительно на 2 ч при комнатнойтемпературе для коагуляции. Послемеханического дробления коагулятаразбавляют 1 объемом физиологического МаС 1-раствора и смешивают дляадсорбции липопротеина с 27 силикатного коагулянта (аэрозил).Центрифугированием получаетсяпрозрачный верхний слой. Из верхнеого слоя при 0-4 С и при рН 7 осаждается при помощи 1,8 М сульфата аммония фракции -глобулина и собирает 0ся центрифугированием. Диализомотносительно 50 мМ ТР 5/0,1 М МаС 1 буферного раствора, рН 7,5, и концентрацией ультрафильтрованием получают пригодный для расщепления ферментами препарат антител.Расщепление папаином.Работают по примеру 1, но проводится некоторая модификация для фракции у-глобулина. 1,57 папаина относятся в 1 г протеина Фракции-глобулина, а время инкубации составляет 20 ч при 25 С. Остальныеусловия одинаковы,Очистка ГАВ-фракции.Алкилированная смесь расщепленияподвергается диалиэу относительнофизиологического раствора хлористогонатрия, затем смешивается с 25 мМсульфата цинка. В результате этого1336941 Формула изобретения Торможение ферментной активности, Х Животное СК-ММ/600-1000 ед/л СК-МВ/200-400 ед/л РАВ-фрагменты Исходная ГАВ -фрагсыворотка ментыЗаказ 4057/59 Тираж 594 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул, Проектная, 4 осаждаются остатки нерасщепленных 190 и Г -фрагментов и отделяются центрифугированием. ОстающиесяГАВ-фрагменты после диализа и кон 5 центрации готовы для применения в СК-МВ-тесте. Выход составляет более 807. тормозящей активности для СКММ-изофермента в пересчете на исходную плазму. СК-МВ тормозится на 503 10 независимо от величины торможения для нерасщепленных антител.В таблице показаны результаты, полученные с различными сыворотками.Предлагаемый способпозволяет по 15 сравнению сизвестным, в котором тормозят СК-ММ полностью и СК-МВ на 60-907 получать одновалентные фрагменты(ГАВ-фрагменты), которые тормозят СК-ММ, а СК-МВ тормозят в рамках 20 предела погрешности только до 502.В результате становится возможным применять полученные от соответствующих подопытных животных(овцы, кролика, курицы и т,п.) антисыворотки 25 для определения СК-МВ, не выделяя предварительно связанными с затратами аналитическими методами тех антисывороток, которые тормозят СК-МВприблизительно более чем на 537.Возможно расщеплять сыворотки безпредшествующего определения их тормозящих свойств протеолитическим путем при восстанавливающих условияхи исключать затем специфически сфрагментами расщепления группу М СКнезависимо от того, имеются ли вмышечном ферменте СК-ММ или в гибрид"ном ферменте СК-МВ. Способ определения креатинкиназы МВ в сыворотке крови путем обработки ее антителами к креатинкиназе ММ, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве антител используют одновалентные фрагменты Г-АВ, выделяемые из фракции 196 или-глобулина антисыворотки к креатинкинаэе ММ, при этом их предварительно обрабатывают ацетамидом йода.