Способ получения рекомбинантного штамма s-формы патогенных эшерихий

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН И 91 11 А 1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) 1-й Ленинградскинститут им. акад, И У 40 ЕРИХИЙ селект культуры о т л и ч а юс целью полуыми свойствавысева ЭШ с по-45 мин0-130 ми агом ппри 36н при экспо ние 4 тем 1 ИЯ РЕКОМБИ ПАТОГЕННЫХ(72) в.в (53) 575 (56) 3 ор кишечные .Медицина (4)(57) НАНТНОГО НИЕ ИЗОБРЕТЕНИ среду м, что с зада еципие т 0,85 натрия количе 010 нт предваритель- -0,907-нымрастдобавляют бакстве 1,0-2,0 микробных клеток, роводят в тече- ,6-37,2 С, а за" 18-22 С.12Изобретение относится к медицине,а именно к микробиологии. Предлагаемый способ может быть использовандля получения новых генетических вариантов патогенных эшерихий с запрограммированньп 4 и изменениями н геноме. Такие штаммы необходимы для отбора продуцентов вакцин, а также для изучения мол кулярно-генетических основ регуляции вирулентности, актигекнОй изменчивости и уточнения генетических картЦель изобретенияполучение рекомбинанткых йтаммов фо м патоге.;ныхВ зшгрхий с, заданными свойствами. Способ осуществляют следующим образом.Трансдуцнруюшттй бактериофаг Р 1 выращивают на культуре-доноре. Для этого 2,5 мл 0,7%-ного аминопептидкого агара при 45-46 С смешивают с 2,0-3,0 10 бактерий и 1,0-2,0108щаговых частиц, выливают на чашки с застывшим 1,5-2,07-ным аминопептидкым агаром и смесь выращивают 15-20 ч при 36,6-37,2 С, после чего смывают 0,7%-ный агар, добавив 1,0" 2,0 мл амикопептидкого бульона. К полученной смеси добавляют 0,3 0,5 мл хлороформа, встряхивают 30 40 с и разделяют центрифугированием при 2000,0-3000,0 об/мин 20-30 мин. Отбирают кадосадочную жидкость, котораь представляет собой лизат фа,га Р 1.В случае получения умеренного варианта фага Р 1 (Р 1 сш 1, с 1 г 100) культуру-донор выращивают при 3032 С н аминогептидном бульоне до концентрации бактериальных клеток2,0-2,510 в мл, Индуцируют фаг,инкубируя бактериальную культуру 35-0 мин прн 40-41 С и 60-65 мик при 36,6-37,2 С.Затем к бульону добавляют 1/10 объема хлороформа и смесь встряхивают 30-40 с. Фаголизат отделяют центрифугированием при2000-3000 об/мин 20-30 мин.Для осуществления трансдукциибактериальную культуру-реципиент вы ращивают в аминопептидном бульоне в течение 15-17 ч, разводят 0,85 0,907-кым раствором хлорида натрия в 3-5 раз и осаждают центрифугиро" ванием при 2500-3000 об/мик в тече" ние 30-35 мин при 18-22 С. Нвдосадочную жидкость сливают, осадок ресус.ендируют в прежнем объеме раствором53141 1 хлорида и вновь огаждают при таком же режиме иектрифугиронания, ПроцетИсходный фаг в количестве 1,0 ф 10гмешали с 2,010 клеток-донорондобавили 2,5 мл 0,77-ного аминопептидного агара при 45 С и после смешивания вылили на чашку с 1,57 аминопептидным агаром. Смесь ныращивали17 ч при 37 С, после чего 0,77-кый,агар был смыт при добавлении 2,0 мл З аминопептидкого бульона. К полученной смеси добавили 0,5 мл хлороформа, смесь встряхивали 40 с к затемразделяли центрифугированием при3000 об/мин 20 мин. Отобрали надоса. дочкув жидкость, которая представляф После четвертого, осаждения из бактерий была приготовлена взвесь, содержащая 1,0 1 О клеток в 1 мл. К1,0 мл такой взвеси добавили 1,0 10 1 О 15 20 25 дуру отмынки повторяют 3-5 раэ. Изобработанных таким образом бактерийготовят нэнесь, содержащую 1,092,0 1 О живых клеток н 1 мл. К 1,0 млтакой взвеси добавляют трансдуцирующттй бактеркофаг в концентрации 1,02,0 10 (0,1 мл), после чего смесь инкубируют прк 36,6-37,2 С в водяной бане в течение 40-45 мин а затем при 18-22 С - 120-30 мин, Смесь центрифугируют при 2500-3000 об/мин 20-30 мин при 18-22 С для осаждения бактерий, Надосадочную жидкость, содержащую неадсорбиронанные фаговые частицы, сливают. Осадок ресуспендируют н 0,3-0,4 мл раствора хлорида натрия и засевают по 0,15-0,2 мл на чашки с селектинной средой, Тра,; - сдуктанты выращивают н течение 48- 50 ч. Отбирают колонии, соответст" вующие Б-формам бактерий,гП р и м е р 1, Передача гена 11 Г 1 от культуры 1 М 12 Тп 10. ла собой лизат Фага Р 1. Культура-реципиент зшерихии 0,124 в Я-форме - нирулентный штамм чт 1240. Выращенные н аминопептидном бульоне в течение 15 - 17 ч бактерии развели 3 раза 0,85%-ным раст-, вором хлорида натрия и осадили центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин при 20 С. Надосадочную жидкость слили, осадок ресуспендировали в прежнем объемераствора хлорида натрия в снова осадили, Процедуру повторили. 4 раза,Предлагаемый способ позволяетвпервые получить рекомбинаты пато"генных эшеризий, находящихся в 3 форме, прн трансдукции фагом Р 1,1 Составитель Н.КузенковаРедактор Л.Лашкова Техред В.Кадар Корректор,С,Черни Заказ 4353 Тираж 490 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 3 1253 трансдуцнрующего бактериофага (бактериофаг был предварительно оттирован по методу Градна на индикаторной культуре ЯР,500). После добавления бактериофага смесь инкубировали при 37,0 С в водяной бане 45 мин, а затем 120 мин при 20 С. После инкубации смесь центрифугировали для осаждения бактерий при 3000 об/мнн в течение 30 мин при 20 С. Надоса дочную жидкость, содержащую неад-. сорбированные фаговые частицы, слили и осадок ресуспендировали в 0,3 мл раствора хлорида натрия. Затем полученную взвесь высеяли на.две чашки 15 с аминопептидной средой, содержацей тетрациклин 15 мкг/мл. Чашки инкубнровали 48 ч при 32 С. Среди колоний, выросших на чашках, отбирали только соответствующие Б-формам. 20 Для отбора СхГ 1 вариантов (й 1 Г 1 соответствует гену гес А 441) отобранные колонии рассевались на амннопептидной среде, содержащей тетра.циклпн 15 мкг/мл и выращивались 48 ч 25 при 32 С. Полученные после этого колонии проверялись на способность к росту мннимальной среде М 9 с миннмальным. агаром 1,5 Х (Мясо). Для этого стерильными спичками каждая 141 4испытуемая колония пересевалась надве чашки с этой средой. Чашки выращивались: одна при 32 С, другаяпри 42"С (известно, что С 1 Г 1 варианты не способны растн при 42 С),Через 48 ч инкубации отобрали колонии, давшие рост при 32 С и недавшие при 42 С. Они соответствовали рекомбинатам с желаеммн свойствами С 1 Г 1 тп 10,Для отбора трансдуктантов в проведенных экспериментах были исполь"зованы следующих их свойства: трансдуктанты, содержащие гены, кодирующне устойчивость к тетрациклину.(тп 10), растут на аминопептидном агаре, содержащем 10-15 мкг/мл соответствующего антибиотика, трансдуктанты,приобретшие ген гес А 56, идентифицируются по возрастанию в 100010000 раз чувствнтельности к УФ-облучению, трансдуктанты, получившиеген 11 1, теряют способность .растина минимальной среде М 9 при 42 С ирастут прн 32 С.