Способ разделения белков и нуклеи-новых кислот

Союз Советских Социалистических Республик(43) Опубликовано 07.03,81. Бюллетень че 9 (45) Дата опубликования описацця 07.03.81 ссср по делам изобретений н открытнй(54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЪХ КИСЛОТ1Изобретение относится к производству биохимических препаратов и может быть использовано на предприятиях, получающих ферменты и нуклеиновые кислоты из оиологического сырья.Источником белков и нуклеиновых кислот часто служат клетки микроорганизмов.Широко известны и хорошо разработаны способы выделения белков (например, ферментов) и нуклеиновых кислот из биологического сырья. Поскольку и белки и нуклеиновые кислоты одновременно присутствуют в клеточной массе (или приготовленном из клеток экстракте) вопрос выделения тех или других биополимеров неразрывно связан с их разделением.Однако существующие в настоящее время способы выделения одного класса биополимеров из экстрактов клеток основаны на денатурации другого класса.В частности, из описанных в лиг-ратуре наиболее эффективен способ выделения белков, заключающийся в том, что экстракт клеток, полученный после отделения оболочек высокоскоростным центриругированисм, обрабатывают протаминсульфатом для удаления рибосом и нуклеиновь;х кислот, фракционцруют белки в различных конпецтрациях сульфата аммония, а даль- нсйшу 1 О очистку проводят жидкостной хро 2матографией и гель-фильтрацией 11. Прц этом один из продуктов биосинтеза (нукленновые кислоты) становится отходом производства.В то жс Врем 51 для цолучснц 51 цуклсццовых кислот, в частности трзнсферцых рцбонуклсиновых кислот (тРНК), экстракт клеток для удаления белков обрабатывают фенолом и дальнсйшую очистку тРНК про водят жидкостной хроматографией Д,Прц применении указанных способовбелки цли нуклецногыс кислоты являются отходами производства, а для удаления нук:1 еиновых кислот цспол 1 зустся дсфицит ный препарат протамцнсульфат.Целью изобрстения является болсе полное использование биологического сырья и предотвращение дснатурации белков и нуклеиновых кислот клеточного экстракта прц рр их разделении.Указанная цель достигается предлагаемым способом разделения белков ц нуклеиновых кислот, содержащихся в клеточном экстракте после удаления клеточных 25 оболочек ц рибосом, заключающийся вионообменноц хроматографии экстракта ца диэтиламцноэтилцсллюлозс в градиенте концентраций солей: МН 4 С, илц ХаС 1, или КС 1 от 0,02 до 0,3 М в буферных 30 растворах с рН 7,1 - 7,5, а затем - МаС810716 1 О 15 20 50 55 Составитель О, Скородумова Техред А. Камыщникова Корректор О. Силуянова Редактор Е. ХоринаЗаказ 251 Тираж 419 Изд. М 235 БИИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 13035, йосква, Я, Раущская наб, д. 4/5Подписное Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлисполкома 3от 0,3 до 0,7 М в Ма-ацетатном буфере р Н 5,0 в 5,5.Существенными отличиями способа яьляются осуществление ионообменной хроматографии экстракта клеток на диэтиламиноэтилцсллюлозс и указанныс условия сс проведения.При осуществлении способа обычно используют клеточный экстракт, полученньй после удаления клеточных оболочск высокоскоростным цснтрифугированием и рибосом -ультрацснтрифугированисм 05000 д). 1 римср 1. 500 г бактериальной массы Езс 1 спсЬа со 11 штамм МКЕ, дсзинтс. грируют растиранием с окисью алюминия, дезинтегрированную биомассу суспсндируот в 800 мл буфсра, рН 7,5, содержащего 0,02 М хлористого аммония, осаждают клеточные обломки и окись алюминия высокоскоростным центрифугированисм прн 27 000и осаждают затем рибосомы ульрацснтрифугированием прн 105000 о. Супсрнатант после отделения рибосом наносят и колонку с ДЕЛЕ-целлюлозой, уравновешенной буфером, рН 7,5, содержащим 0,02 М хлористого аммония, сгпоци)о бел. ков провод 51 Т В градис 11 тс концсптрации хлористого аммония от 0,05 до 0,3 М. Затсм Д:ЛЕ-цслли)лозу уравноьсшизают 0,05 М натрий-ацетатным буфером, р 1-1 5,0, софсржащим 0,3 М хлористого натрия и гР 11 К элюиру 1 от повышением копсптрации хлористого натрия до 0,7 М.11 з белковой фракции выделяют в чис. том виде фактор элонгации Г 1 Е 1.-Ст) в количсствс 220 мг, выход тРНК составляет 1 г.Примср 2. 100 г клеточной массы Е. СО 1, М ЙЕ, инфицированной бактериофагом Т 4 а)нЬ,гЪ 82, суспендируют в 300 мл 0,01 М трис НС буфера, рН 7,6, содержащсго 0,001 М хлористого магния, и 0,01 М мсркаптоэтанола (буфер Л). Клетки разруша От ультразвукоу(. Клс Очг 1 ыс Обло)мки осаждают цснтрифугированием в роторе Вес(иап) при 35 000 об/мин в течение 3 ч. Супернатант наносят на колонку 5 ХЗО см с ДЕЛЕ-нсллюлозой со скоростьо 250 мл/и. После промывки колонки 1,5 л буфера Л до исчезновения поглощения на длине волны 280 нм элюируют белки в линейном градиенте из 0,02 и 0,3 М хлористого натрия в буфере А (общий обьсм гра 25 30 35 40 45 4диента 6 л). Фракции Д 1-1 К- и РНК-лигаз определяют по комплексообразованию зН АТФ, Фракцию ДНК-лигазы далее очищают хроматографией на фосфоцеллолозсгидроксилапатите. Выход составляет 21,8% от активности в грубом экстракте. Фракцию РНК-лигазы далес очищают хроматографией на гидроксилапатитс и гель- фильтрацией на ультрагеле ЛСА. Выход составляет 36,5% от содержания в грубом экстракте.После элюции ДНК- и РНК-лигаз колонку с ДЕЛЕ-целлюлозой уравновешивают 0,05 М натрий-ацетатным буфером, рН 5,0, содержащим 0,3 М хлористого натрия. тРНК элюируют этю жс буфером, содержащим 0,7 М хлористого натрия. Выход тР 1-К составляет 50 мл. Формула изобретения 1. Способ разделения белков и нуклеиновых кислот, содеркац 1 ихся в клеточном экстракте после удаления клеточных оболочек и рибосом, отличающийся тем, что, с целью предотвращения дснатураци "1 б)елков или нуклеиновых кислот и более полного использования биологического сырья, разделение осуществляют ионообмен. пой хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозс в градиенте концентрацией солей: хлористого аммония, или хлористого натрия, или хлористого калия от 0,02 до 0,3 М в буферных растворах с рН 7,1 - -7,5, а затем - хлористого натрия от 0,3 до 0,7 М в натрий-ацетатном буфере рН 5,0 - 5,5.2. Способ по п, 1, отл ич а ющи йся тем, что используют клеточный экстракт после удаления клеточных оболочек высокоскоростным центрифугированием и рпбосом - ультрацентрифугированием(105 000 д). Источники инфопмации,принятые во внимание при экспертизе