Способ получения иммобилизован-ной полирибонуклеотидфосфорилазы

Сова Советских Социалистичесивх Республик(54) С 110 СОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ И РИБОНУКЛЕОТИДФОСФОРИЛАЗ10 Изобретение относится к микробиологи. ческой и медицинской промышленности, в частности к способу получения иммобилизованного фермента - полирибонуклеотидфосфорилазы, широко применяемой в синтезе полинуклеотидов.Известен способ получения цммобилцзованной полириоонуклсотидфосфорилазы путем связывания ес с силикагслем, нссу. гцим активные остатки альдсгида, присосдицспныс по связи 51 - С в среде буфера при 4 - 6 С и соотношении фермент; носитель 1: 10. Для стабилизации иммобилизованной полирибоцуклеотидфосфорплазы образовавшуюся между белками и альдегиднь 1 ми группами силикагеля связь стабилизируют восстановлением ооргидрпдом натрия в обратном буфере.С 1 г силикагсля связывается 41 - .51 мг белка. Период полужизни иммобилизованного фермента составляет 25 суток. Кочичество несвязанного фермента 50%. 11.Недостатками известного способа являются сравнительно невысокая активность иммобилизованной полирибонуклеогидфосфорилазы (66 - 120 ед.), так как недостаточна стспспь со.;ранения первоначальной активности фермента в процессе иммобилизации (57 - 68%) в результате потсрь изза длительности процссса: отцоспгельцо короткиц срок полужцзнц нммооцлизованного фермента.Целью изобретения является увеличение активности и повышение срока полужизни пммобцлпзовацной полирибоцуклеотидфосфорплазы.Указанная 11 сль достигается тем, что в известном способе получения иммобилизованной пол ирцбонуклеотидфосфорилазы з качестве носителя используют гидроокись ал 1 оминия в у-форме, которую предварительно активируют выдерживанием в воде при 0 - 8 С в течение 4 месяцев, и связывание фермента с носителем проводят при соотношении соответственно 1: (21,5 - 22,5) и нри тсмпсратурс 8 в 20,Такой способ обеспечивает активность готового продукта - иммобилизованной полирибонуклеотидфосфорилазы - 120 - 150 ед. (активность по АДФ), срок полужизни - 38 - 40 суток.Предлагаемьш способ получения иммобилизовацной полцрибонуклеотидфосфорилазы заключается в связывании ее и срсдс буфера при 1820 С с гидроокисыо агпо мгпшя в у-форме, которую предварительно активируют выдержцванием в воде прц 0 - 8 С в течение 4 месяцев при соогношснии фермент: носитель 1: (21,5 - 22,5).По выли си ив а ктц вности им мобил и зова и.Редактор 3. Бородкина Корректор О, Силуяноза Тираж 49 Изд. Л. 233 В НИИГ И Государственного комитета СССР ио делам изобретений и открытий 3035, Москва, )К, Раушская наб, д. 4 3Гт.од п 1.с нее Заказ 23 Загорская тииография Уириолиграфиздага Мособлиси,ИОЙ ц 1 црибоцуклотидфосфорилс 13 ы 1 Остцгястся за счет сохранения естественнойцс 1301 яч 11 л ьпой я ктпвпостп фс)мсцта.11 оситсль - гидроокись ал омиция3-Л 1(0 Н ) ., ха ра ктеризуется вь 1 сокой адсорбппоцпой способностью за счет возникцовсцп 51 водородных связей, я тякжс 00:и,ИОй п;Ощад 110 коптяктиру 10 щ 1 й ИОвсрхцостц, что способствует повышении) скорости и эффсктивностп адсорбции,Стаоильпость и устойчиВость с 13 язи ИОсптль-фермент повышается в процессепрс;1 варительпой обработки носителя вВодном растворе. Предварительная активация увеличивает адсорбционную способность гпдроокиси ялк)мипия за счег обраЗОВЯНИ 5 допОлцис,ьцых ВОдОродцых с 1351.зц.Короткий срок иммобилизации (10 мин)прсдотврашаст ицактивацик фермента.ТлИратурз 1 процесса 18- - 20 С также обеспечивает оптимальность сохрансния яктивцоси В процессе иммобилизации полирпбопуклсотпдфосфорилазы. Соотношеццферме нт: носитель создаст среду иммобп 1 ИЗЯППЦ, ООССПСЧИВЯЮЩУ 10 ПО;1 ЦОЕ СВЯЗЫВЯнис фермггя - . 100 о 4, что также прсдотВряп 1 яст Оорязовяцис цссвязяц 1 юго Ос,ка ивозникающие црц этОм потери акти 1 пост.У,1)1 И 1 пцсрока ИОлу)кпзни фермента (с 25 до 40 супж) свидетельствует обустойчивости и стабильности иммобилизованной полирпоонуклеотидфосфорилазы иобеспечивается за счет высокой степениЧ 11 стоты ядсоропровяццого фсрмсптя и возрастания степпи связьп 3 яиия белка и ноСИТСЛ 51,Г 1 рцСр 1. К 16 мл сусицзин 1,01 г у-Л 1(ОН) з, предварительно акти 3 ированнойвыдсржпвапцсм в тсчсцпс 4 месяцев в водном растворе при 0 - 8 С и обработанной5 мл 0,5 М трис-1 С 1 буфером, рН 8,1, прцбавл 5 пот 150 сд. (45 мг белка) по;1 ирибоцуклсотидфосфорилазы из Е. со 1 при комнатной температуре и перемешивании в тс.чение 10 миц (время адсорбции) г 1,ля оп 1)едсзеИя активности фермента инкубиру 4нт при 37 С 1 м. реакционной смеси, со.1 Сркащс 41, мкммоль: ЛДФ 25; грцс-НС 1- буфр 100; Мо (СНзСОО)в 10 (р 11 8,0) и фермент. 1 г у-Л 1 (01-1), связыванг 45 м 5 белка с активностью 150 сл. Выход активности 100 о/о.Пример 2. К 48 мл сусицзин 13,3 гу-Л 1 (ОН) з, предварительно активирован.ной выдерживанием в тсчспис 4 месяце:, О в водном растворс при 0 - 8 С ц обработанной 25 мл 0,5 Ч трис-НС буфером, рН 8,1, прибавляют 2070 ед. (621 мг белка полирибоцуклсотидфосфорилазы из 1=со прп комнатной температуре и перемешивании о в течение 10 мин (время адсорбцпи). Определяют активность фермента. 1 г у-Л 1 (ОН), связывают 45 мг белка с активностью 150 ед. Выход активности 100 Ъ.Определение активности полцрцбонук.20 лсотидфосфорилазы: Лктивность-результатпо кривой ( разведение У, 2 (инкубация 30 мцн Х пересчет на 1 мл) = 0,02 Х 1 ОУ.и;2 Х 20-8 ед.зл (4 СДЛ 1 г склка). 25 Формула изобртсц 11 я Способ получения иммооилизовяццойпол ирцбонуклеотидфосфорпл азы путем связывания ее с неорганическим )одонс растворимым носителем в буферно 1 Сред,о гл и чаю щи йся тем, что, с цел)ио ув:- личения активности и повышения срока полужизни цммобилизовацной полирибоцуклеотидфосфорилазы, в качестве посптс ля использу 1 от гидроокись агпоминия зу-форме, которую предварительно активируют выдерживанием в воде при 08 С и тсчсие 4 месяцев, а связывание фермента с носителем проводят при соотношении со ответственно 1: (21,5 - 22 л) и цри температурс 18- - 20 С. 11 сточники информац 1.и,принятые во внимание ппи эксперт:3 Лвторс, Ое свидете.1 ьг-гзг ССС г) Мз 498315, кл. С 07 С 702. 1974 Ироготип).