Способ выделения нуклеиновых кислот из активного ила

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ п 11 54864 Союз Советских Социалистических Республик(51) М. Кл, С 07 Н 21/00 Государственный комитет Совета Министров СССР по делам изобретений(71) Заявитель А, С. Долобовская и А. И. Щетинин Всесоюзный научно-исследовательский институт водоснабжения,канализации, гидротехнических сооружений и инженерной гидрогеологии ВОДГЕО, Отдел водного хозяйства промпредприятий г, Харькова(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ АКТИВНОГО ИЛАИзобретение относится к области получения нуклеиновых кислот и может применяться на соответствующих производствах микробиологической промышленности.Известны два способа выделения нуклеиновых кислот из ила сточных вод.При осуществлении одного из них активный ил, образующийся при очистке сточных вод, обрабатывают органическим растворителем, например ацетоном, а затем осадок экстрагируют раствором, содержащим одновалентный металл, например раствором 1 чаОН, Экстрагированные биополимеры, содержащие нуклеиновые кислоты, белки и полисахариды, осаждают двумя объемами этанола, осадок растворяют, а нуклеиновые кислоты очищают, например, депротеинизацией 1.Недостатком данного способа является денатурация ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) и деградация РНК (рибонуклеиновой кислоты) под действием щелочи,Второй способ является более близким к предлагаемому способу выделения нуклеиновых кислот из активного ила. При осуществлении этого способа активный ил экстрагируют раствором комплексообразующего агента, например этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) или нитрилотриуксусной кислоты. Рекомендуемый для экстракции водный раствор содержит 2/, ЭДТА и имеет рН 10, Процесс ведут при температуре 0 - 4 С. Экстрагированные биополимеры, содержащие нуклеиновые кислоты, белки и полисахариды, как и 5 в предыдущем способе, осаждают, например,двумя объемами этанола, осадок растворяют, а нуклеиновые кислоты очищают, например, депротеинизацией.Недостатками данного способа получения 10 нуклеиновых кислот является образованиесточных вод, содержащих ЭДТА, которая относится к веществам практически неразлагаемым при биологической очистке этих стоков.Кроме того, в растворах ЭДТА затруднена де протеинизация, так как в этих растворах непроисходит диссоциации ( нуклеопро геидных комплексов на нуклеиновые кислоты и белки, что снижает выход целевого продукта.С целью применения для экстракции нукле иновых кислот веществ, легко разлагаемыхмикроорганизмами и облегчающих депротеинизацию полученных растворов нуклеиновых кислот, предлагают проводить экстракцию активного ила раствором вещества, разрушаю щего водородные связи и нарушающего гидрофобные взаимодействия в биополимерах, а именно 3,0 - 8,0 М раствором мочевины.В отличие от ЭДТА, мочевина является продуктом легко усвояемым бактериями и расте548614 Количество Д.К (мг(г сухого васа) в экстракте Концентрации мочевины Моль/лв сутки 0,562 0,554 0,818 0,8951,227 2,199 0,588 0,818 1,023 1,406 1,866 2,148 0,869 0,972 0,920 1,483 1,320 1,534 3,323 3,903 4,730 6,367 6,996 8,440 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 8,0 3 6 12 18 24 48 0,665 0,920 0,997 1,483 1,483 1,636 0,639 0,639 0,972 1,100 1,100 0,920 пнями. Сточные воды, образующиеся при получении нуклеиновых кислот из активного ила предлагаемым способом, могут быть легко очищены биологическим способом или после соответствующей обработки использованы как удобрения для сельского хозяйства,Использование мочевины в качестве экстрагирующего раствора облегчает дальнейшую депротеинизацию раствора нуклеиновых кислот, так как многие белки в концентрированных растворах мочсвины денатурируют, а комплексы нуклеиновых кислот диссоциируют.Пример.Суспензию активного ила центрифугируют (3 тыс. Об/мин., в течение 2 - 3 мин), надосадочную жидкость сливают, осадок охлаждают Как видно из представленных данных, нуклеиновые кислоты из активного ила экстрагируются с удовлетворительным выходом раствором 3,0 - 8,0 М мочевины.Экстрагированные нуклеиновые кислоты осаждают известным способом, например, двумя объемами этанола, осадок растворяют. например, в 0,15 М хлористого натрия - 0,015 М цитрате натрия 1 рН - 7,0) и очищают от примесей, например, встряхиванием со смесью хлороформ - изоамиловый спирт (24: 1).Использование предлагаемого способа получения нуклеиновых кислот из активного ила по сравнению с существующим способом обеспечивает биологическую очистку сточных вод, образующихся в процессе обработки активного ила; кроме того, облегчается очистка полученных экстрактов от белков.П р и м е р. Суспензию активного ила центрифугируют (3 тыс, об. мин) в течение 2 - 3 мин, надосадочную жидкость сливают, осадок охлаждают на льду. Охлажденный осадок заливают предварительно охлажденным на льду раствором 4 моль (24%) мочевины и суспендируют в нем.Во избежание денатурации нуклеиновых кислот все операции проводят при 0 - 4 С.Время экстракции 4 час.Экстрагированные нуклеиновые кислоты Осаждают двумя объемами этанола. Полученный осадок содержит 57,1% белка, 42,9% нуклеиновых кислот, из которых 14,5% РНК.Осадок растворяют в растворе 0,15 М хлористого натрия - 0,015 М цитрата натрия, рН на льду, Охлажденный осадок заливают предварительно охлажденным на льду раствором 3,0 - 8,0 М мочевины и суспендируют в нем.Во избежание денатурации, экстракцию 5 нуклеиновых кислот проводят при температуре 0 - 4 С. Общее время экстракции зависит от концентрации мочевины в используемом растворе. 10 В таблице приведены данные по выходуДНК при экстракции активного ила растворами с различной концентрацией мочевины, время одной экстракции 1 час.Влияние концентрации мочевины и количе ства экстракцнй на выход ДНК из активногоила. 7,0 и очищают от белка встряхиванием с равным объемом смеси хлороформ - изоамиловый спирт (24: 1). Суспензию разделяют20 центрифугированием, водный слой осторожноотбирают и сохраняют для последующих операций. Промежуточный слой промывают0,15 М хлористым натрием - 0,015 М цитратомнатрия посредством взбалтывания с последу 25 ющим центрифугированием, Промывную жидкость объединяют с ранее отобранным водным слоем,Процедуру осаждения и встряхивания сосмесью хлороформ - изоамиловый спирт пов 30 торяют еще один раз,После этого нуклеиновые кислоты осаждают двумя объемами этанола, Конечный выходнуклеиновых кислот составляет 8 мг/г сухоговещества ила. Содержание белка в препарате35 составляет 1 - 10%. Формула изобретенияСпособ выделения нуклеиновых кислот изактивного ила путем экстракции при темпера 40 туре 0 - 4 С с последующим осаждением иочисткой, отличающийся тем, что, с целью очистки сточных вод и повышения выхода целевого продукта, экстракцию ведут3,0 - 8,0 М раствором мочевины.45 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1. Патент Японии45-13827, кл. 16 Р 8,1970,2. Патент Японии45-13828, кл, 161 8,50 1970 (прототип) .