Способ иммобилизации ферментов

пщ 5486 И Союз Советских Социалистических Ресаублик(23) ПриоритетОпубликовано 28.02.77. БюллетеньДата опубликования описания 15,08.7 7 Ст 7/02 1 К 37/4 51) М. Кл осударственнын комитет овета Министров СССР ча денете изобретенийи открытий. Антонов Институт биоорганической химии им, М. М. Шемякина 1) Заявител 54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕ полимеров, однако, если активирующие реагенты, карбанилдиимидазол, моя ный остаток и в такого вированный носитель с зольные группы использовать мягкие такие, например, как но ввести имидазольтнпа носители. Акти- одержит ацилнмида, сн=-СНС 0- ГСН.= Ст Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов, которые могуг найти широкое применение в пищевой, химической, микробиологической промышленности, а также в лабораторной и медицинской практике. Известно большое количество способов иммобилизации ферментов на водонерастворимых носителях. В частности, известен способ иммобилизации ферментов на сополимере этилена и малеинового ангидрида 11.Недостатком этого способа является значительная солюбилизация иммобилизованного фермента и ограниченность типов применяемых носителей.Предложен способ получения иммобилизованных ферментов на карбоксилсодержащих полимерах посредством образования ковалентной связи между карбоксильной группой матрицы и свободными функциональными группами белков. Отличительным признаком метода является предварительная активация карбоксильных трупп носителя. Активация достигается обработкой носителя, содержащего свободные карбоксилыные пруппы, хлористым тионилом, а затем имидазолом. Иммобилизацию фермента проводят путем контактирования раствора фермента с активированным носителем. Предложенный способ введения имидазола не пригоден для углеводсодержащих которые могут вступать в реакцию ацилиро.вания со свободными функциональными группами белков (НМ-группы, Н 5 - группы цистеина, НОчгруппы тирозина и т. д.).15 П р и м е р 1. Получение активнрованногоносителя.К 12 г полиметакриловой смолы - Апйег 111 е ССт, тип 11 (1., Р, С. С 1 теппса 1 з Руез, Великобритания) в 100 мл абсолютного хло роформа (бензола) приливают 12 мл хлористого тионила и смесь кипятят в течение 3 - 5 час до прекращения выделения хлористого водорода. Избыток хлористого тионпла и растворитель отгоняют, затем последовательно 25 дважды добавляют по 50 мл абсолютного хлороформа (бензола) и упаривают смесь досуха, К сухой смоле прибавляют 5,г имидазола, 60 мл хлороформа и 10 мл триэтиламина. Реакционную смесь кипятят с обратным холо дильником в течение 4 час. Смесь переносят548613 Формула изобретения Составитель А. Бочаров Техред И. Карандашова Редактор Л. Герасимова Корректор Е. Хмелева Заказ 1674/1 Изд. Мо 633 Тираж 589 НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное Типография, пр. Сапунова, 2 3на фильтр и тщательно отмывают от избытка реагентов абсолютным хлороформом, Слегка желтоватый порошок активированного носителя при хранении в вакуум-эксикаторе над Р 20 з по крайней мере в течение 2 месяцев сохраняет способность реагировать с ферментами, Согласно результатам микроанализа полученная смола содержит 1,76% азота, т. е. приблизительно 10% свободных карбоксильных групп вступает в реакцию с имидазолом.П р и м е р 2. Иммобилизация а-химотрипсина,1 г активированното носителя тщательно промывают 3 М раствором ХаС 1 в ацетатном буфере (рН 5,5), а затем буфером (ацетатным 50 мм или трис-НС 1, 0,1 М) до рН в промывных водах, при котором предполагают проводить иммобилизацию, К смоле, подвергнутой такой обработке, прибавляют 250 мг а-химотрипсина в 6 - 10 мл соответствующего буфера. Реакционную смесь инкубируют при перемешивании в течение 3 часов при 25 С или 18 час при 4 С. После инкубации реакционную смесь переносят на фильтр и многократно промывают 3 М раствором КаС 1 в ацетатном буфере до полного удаления белка, связавшегося со смолой за счет ионообменной сорбции. Количество иммобилизованного а-химотрипсина (мг/г носителя), определенное по скорости гидролиза и-нитрофенилацетата при трех значениях рН 5,5, 6,7, 8,5 составило соответственно 3 - 4, 22, 40 - 50.П р и м е р 3. Иммобилизация фосфодиэсте 5 разы яда гюрзы,К 1 г активированного носителя, обработанного, как в примере 2, приливают раствор фосфодиэстеразы с удельной активностью 25 ед/мл.Общее количество фермента в инкубационной10 смеси приблизительно 100 ед. После инкубации полученный препарат промывают, как впримере 2. Содержание активного ферментана носителе при проведении иммобилизациипри рН 6,7 составляет приблизительно 3% от15 взятого в реакцию количества,Способ иммобилизации ферментов путем 20 нанесения фермента на носитель - карбоксилсодержащий полимер, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса иммобилизации, носитель предварительно активируют хлористым тионилом, а затем имидазо лом.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1, Патент США М. 3616229, кл. 195 в ,1971 (прототип).