Способ выделения -аспарагиназы

Союз Советских Социалистических РеспубликОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(45) Дата опубликования описания 18.05.77(51) М, Кл,е С 12 О 13/10 Государственный комитет Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий(71) Заявитель Всесоюзный научно - исследовательский институт антибиотиков(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ 1. - АСПАРАГИНАЗЫ Изобретение относится к способам получения медицинских препаратов, а именно фермента- аспарагиназы ( 1 - аспарагинамидогидролазы - 3, 5, 1, 1), обладающего противоопухолевой активностью.Известен способ получения препарата 1 - аспаоагиназы из биомассы микроорганизма Е.Со Р 1, заключающийся в том, что биомассу, отделенную от культуральной жидкости, обрабатывают смесью воды и ацетона, после чего фермент экстрагируют из биомассы водой при рН 7,5-7,8 и для отделения бесклеточного экстракта в суспензию вводят раствор органического основания. Фермент осаждают из бесклеточного экстракта 4 объемами ацетона, полученный осадок отделяют, промывают ацетоном и высушивают, получая грубый препарат фермента с удельной активностью 3 МЕ/мг белка. Последующая очистка 1 - аспарагиназы состоит в нагревании раствора фермента до 60 С при рН 8,5 с целью удаления балластных белков, повторном фракционировании ацетоном, фракционированном разделении белков полиэтиленгликолем в щелочной области рН в присутствии амидов, отделении балластных белков путем повторного прогревания раствора фермента в присутствии глицина или подкисления его, фракпионированном осаждении фермента при рН, соответствующем его изоэлектрической точке, Выход- аспарагиназы судельной активностью 190-203 МЕ/мг белка составляет 24-34% Г 1.5 Цель изобретения состоит в упрощении процесса и увеличении выхода целевого продукта.Для этого в предлагаемом способе ферментосаждают из бесклеточного экстракта при рН 6,8-7,2 ацетоном в соотношении ацетон: бесклеточ ный экстракт 0,8-1,0:1,0, полученный осадок растворяют и после его осветления фракционно осаждают балластные белки и 1 - аспарагиназу полиэтиленгликолем при рН 5,0.5,5. Далее фермент очищают двукратной перекристаллизацией из раствора снача 1 н ла в присутствии этанола при рН 5,0-6,0, а затемполиэтиленгликолем при рН 5,0-5,5.Способ выделения 1 - аспарагиназы заключаетсяв следующем. Биомассу, полученную в результате культивирования микроорганизма Е, Со 1, обраба тывают ацетоном, затем фермент из оиомассы извлекают водной экстракцией при рН 6,8-7,2 и бесклеточный экстракт отделяют после добавления к суспензии водорастворимого анионита, фермент осаждают 0,8-1,0 объемом ацетона, осадок раство ряют и полученный прозрачный раствор, содержа543671 Тираж 578 ЦНИИПИ Заказ 6125/53 Подписное Филиал ППП " Патент ", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 щий 1. - аспарагиназу, обрабатывают при рН 5,0-5,2 полиэтиленгликолем для последовательного осаждения балластных белков и фермента. Последтющая очистка 1 - аспарагиназы состоит в перекристаллизации фермента из буферного раствора при рН 5,0-6,0 в присутствии этанола, и затем при рН 5,0- 5,5 в присутствии полиэтиленгликоля.Предлагаемый способ позволяет получить препарат- аспарагиназы с удельной активностью 180-220 МЕ/мг белка при выходе 45-50%.П р и м е р 1. Клеточную биомассу с общим содержанием фермента 7,0 млн. МЕ, полученную в результате культивирования микроорганизма Е. Со ,штамм Н, в ферментере емкостью 1500 л, отделяют сепарированием, обрабатывают двумяо объемами ацетона в течение 30 мин при 0-2 С в аппарате, обеспечивающем интенсивное перемешивание суспензии. После отделения ацетона биомассу гомогенизируют в воде, взятой в двукратном количестве по отношению к весу биомассы, Экстракцию фермента ведут при интенсивном перемешиваяи в течение 1 час, температуре 30 С и рН 6,8-7,0,поддерживаемом 1 н,уксусной кислотой, Затем суспензию, охлажденную до 4-6 С (при этой температуре ведут все последующие операции), обрабатывают водным раствором полимерного анионита, например поли - 4 - винил - 1 ч - бензилтриметиламмонийхлорида, и бесклеточный экстракт отделяют фильтрованием. Получают 5,2 млн. МЕ фсрментативной активности. К экстракту постепенно при леремешивании добавляют ацетон в количестве 0,8 объема по отношению к обрабатываемому раствору и выпавший осадок отделяют сепарированием. Осадок, содержащий 4,7 млн. МЕ- аспарагиназыс удельной активностью 40 МЕ/мг белка, растворяют в 0,02 М ацетатном буфере, раствор осветляют и при рН 5,0 добавляют товарный раствор полиэтиленгликоля с мол. в. 1500 до 6%-ной концентрации его в растворе, удаляют вьщавшие балластные белки и концентрацию полиэтилснгликоля в растворе доводят до 9%. При этом выпадает в осадок фракция, содержащая 85%- аспарагиназной активности обрабатываемогоо раствора, Удельная ак тивн ость в озрастает до 165 МЕ/мг белка. Наблюдается кристал. лизация фермента в форме мелких игольчатых кристаллов, Полученный осадок растворятот в аммонийно-ацетатном буфере (рН 5,0) и фермент осаждают, добавляя 30% (об/об) этанола, Кристаллический осадок содержит 80% общей ферментативной активности. Последующую кристаллизацию проводят из того же буфера в присутствии 6 Я полиэтиленгликоля. Осадок растворяют в летучем буфере и лиофильно высушивают. Получают около 15 г препарата с удельной активностью 200 МЕ/мгбелка,П р и м е р 2. Биомассу Е.Со 1, штамм 980, обработанную ацетоном, подвергают водной экстрак 5 ции, поддерживая рН 7,0-7,2 в течение 1-1,5 час. Послеобработки суспензии полимерным анионитом ВА получают бесклеточный экстракт с удельнойактивностью 6,9 МЕ/мг белка и суммарным содер.жанием- аспарагиназы 1,8 млн. МЕ. Раствор фер 10 мента далее обрабатывают равным объемом ацетонаи отделяют выпавший осадок, который представляет собой сырец- аспарагиназы с удельной активностью 30 МЕ/мг белка. Выход на данной стадиисоставляет 1,5 млн. МЕ- аспарагиназной актив 15 ности. Далее очистку ведут по примеру 1.Пример 3, Осадок фермента, полученный врезультате фракционирования по примеру 1, растворяют в аммонийно-ацетатном буфере (рН 5,9),осветляют и фермент осаждают равным объемом20 этанола. После 2,5 час размешивания в осадокпереходит 80% ферментативной активности. В этихусловиях осаждения происходит более эффективное отделение пигментов, сопутствующих ферментуна предыдущих стадиях, Далее фермент переосаж 25 дают полиэтиленгликолем и доводят до лиофильновысушенного препарата по примеру 1.Формула изобретения 1, Способ выделения- аспарагиназы, прсдус.30 матривающий отделение биомассы от культуральной жидкости, обработку ацетоном для разрушения клеточной оболочки, экстракцию фермента из биомассы, осаждение фермента ацетоном, растворение полученного осадка, осаждение балластных белков 35 из раствора полиэтиленгликолем, осаждение фермента из очищенного раствора полиэтиленгликолем, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, осаждение фермента ацетоном осуществляют 40 при соотношении ацетон: экстракт, равном0,8 - 1,0:1,0 при рН 5,0 - 7,5, а осаждение фермента из очищенного раствора полиэтиленгликолем осуществляют при рН 5,0 - 5,5, после чего фермент очищают переосаждением этанолом и полиэтиленгликолем.45 2. Способ по п.1, о тли ч ающий ся тем, чтопересаждение фермента этанолом и полиэтиленгли.колем осуществляют соответственно при рН 5,0-6,0 и рН 5,0-5,5. 50 Источники информации, принятые во вниманиепри экспертизе:1. Патент Великобритании У 1212136, классС 3 Н 3, 1970 (прототип) .