Способ получения ферментного препарата для количественного определения тиаминдифосфата в биологических объектах

СОЮЗ СОВЕТСКИСОЦИАЛИСТИЧЕСКРЕСПУБЛИК 9) 5 С 12 И 9/02 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ УЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГООЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕОСФАТА В БИОЛОГИЧЕСКИХ и другой биоло целью диагност статочности при )х слоев населе условиях клиник кои жиданнейе,цованистациов обыч ч крови илкости сВ -недоразличинарных ние относ хноа Изобрет логии полу тов из мик может быть к к о и ения ферментныхобиологическогоиспользовано в препарсырьяермент промьппленлекс - дл ния уровн тновод на жи в виях а такжеыращивании мол я е п ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМПРИ ГКНТ СССР К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт биохимии АН БССР (72) И,П.Черникевич, Э.А.Гриценко и А.Ф.Макарчиков(56) 011 г 1 п.1, Леаз Ругцчаее ПесагЬоху 1 азе (2 - ОхоасЫ СагЬоху - 1,уазе ЕС 4,1,1,1), Ассау оГ ТЬдаш 1 пе РугорЬозр 11 аСе, МеГЬосз 1 п Епгушо 1 ояу. 1970, ч 18 А, х. 109-115.Авторское свидетельство СССР ) 1541255, кл. С 12 И 9/88, 1988.(54) СПОСОБ ПОЛПРЕПАРАТА ДЛЯ КЛЕЕИЯ ТИАМИНДИФОБЪЕКТАХ(57) Изобретение относится к способаполучения ферментных препаратов измикробиологического сырья и можетбыть использовано в ферментной промышленности, а получаемый комплексдля количественного определения уровня тиаминдифосфата (ТДФ), Цель изобретения - расширение технологических сти, а получаемый компколичественного определетиаминдифосфата (ТЛФ) в возможностей способа, ускорение процесса и удешевление целевого продукта.Способ предусматривает использованиесвежей пастообразной массы пивныхдрожжей 7-9 регенераций. Готовят суспензию для экстрагирования белковогопрепарата, которую обрабатывают ультразвуком с частотой 20-22 кГц в течение 18-25 мин с последующим двухэтапным фракционированпем ацетономи сульфатом аммония. На первом этапеацетонового фракцнонирования на каждые 100 мл дрожжевого экстракта добавляют 55 мл ацетона, а на втором -10 мл. Заключительную очистку выполняют адсорбционной хроматографией нааксиапатите элюцией комплекса 0,12 Мфосфатным буфером до соотношения пируватдекарбоксилазной и алкогольдегидрогеназной активностей в ферментном комплексе 1 : (0,15-0,5) при пируватдекарбоксилазной активности неменее 14 ед. акт./мг белка, Послезаключительной очистки белкового препарата получают апопируватдекарбоксилазу в составе комплекса с последующей его стабилизацией, 3 ил. 3 табл50 вотноводческих комплексах и в зверохозяйствах.Определение общего ТДФ в биологических объектах осуществляют ферментативном методом, который основан на способности дифосфорного эфира как кофермента рекомбинировать в апопируватдекарбоксилазой. Образующаяся при этом активная холоформа белка 10 ок.сляет пируват до уксусного альдегида, который в сопряженной системе с алкогольдегидрогеназой и восстановленным никотинамидадениндинуклеотидом (НАДН) превращается в этиловый 15 спирт. 0 скорости реакции судят по снижению поглощения НАДН при 340 нм. Количественное содержание ТДФ, пропорциональное акт вности образовавшейся холопируватдекарбоксилазы и 20 убыли восстановленного НАД, находят по калибровочному -рафику с известными концентрациями кофермента, Основ ными компонентами системы, обеспечивающими рекомбинацию тиаминдифосфата 25 и последующее окисление пирувата, а затем и НАДН, служат алкогольдегидрогеназа и апопируватдекарбоксилаза.Цель изобретения - расширение технологических возможностей способа, ускорение процесса и удешевление целевого продукта.способ осуществляется следующим образом.Берут свежую пастообразную массу пивных црожжей БассЬатошусез саг 1 зЬег 8 епзхз 7-9 регенераций и готовят суспензию для экстрагирования белкового препарата. Приготовленную суспензию обрабатывают ультразвуком с частотой 20-22 кГц в течение 18-25 мин и проводят двухэтапное фракционироаание ацетоном и сульфатом аммония, На первом этапе ацетонового Фракционировапия на каждые 100 мп дрожжевого45 экстракта добавляют 55 мп ацетона, а на втором - 10 мл ацетона. Затем выполняют адсорбционную хроматографию на гидроксиапатите элюцпей комплекса О, 12 М Фосфатным буфером до соотношения пируватдекарбоксилазной и алкогольдегидрогеназной активностей в полученном Ферментном комплексе 1:(О, 15-0,5), причем пируватдекарбоксилазная активность должна составлять не менее 14 зд.акт./мг белка.После заключительной очистки на гидроксиапатите белкового препарата получают апопирудатдекарбоксилазу в составе комплекса с последующей его стабилизацией, так как Ферментативный метод определения ТДФ в биологических объектах с использованием Ферментного комплекса основан на способности дифосфорного эфира как ко фермента рекомбинировать с апопирува".декарбоксилазой.Наилучший эффект от использования способа наблюдается при проведении ацетонового фракциониронания на первом этапе добавлением 55 мл ацетона на каждые 100 мл дрожжевого экстракта и заключительной очистки целевого продукта элюцией комплекса 0,12 М фосфатным буфером до соотношения пируватдекарбоксилазной и алкогольдегидрогеназной активностей в ферментном комплексе 1:(0,15-0,5), при пируватдекарбоксилазной активности не менее 14,0 ед.акт./мг белка.Увеличение количест ю вносимого ацетона свыше 55 мл на каждые 100 мл дрожжевого экстракта на первом этапе ацетонового фракционирования ведет к удалению из ферментного комплекса одного из двух компонентов - алкогольдегидрогеназы. При повышении первоначального объема ацетона от 58 до 60 мл, добавляемого на каждые 100 мл дрожжевого экстракта, Ферментный комплекс содержит остаточные концентрации (следы) алкогольдегидрогеназы, а увеличении количества ацетона свыше 60 мл - алкогольдегидрогеназа в комплексе не обнаруживается. Уменьшение объема ацетона ниже 55 мл, добавляемого на каждые 100 мл дрожжевого экстракта, резко снизит содержание пируватдекарбоксилазы в ферментном комплексе. При добавлении 52-53 мл ацетона на каждые 100 мл дрожжевого экстракта ферментный комплекс содержит следы пируватдекарбоксилазы, при внесении 54 мл ацетона - активность пируватдекарбоксилазы снижена.Увеличение молярности фосфатного буфера свыше 0,12 М ведет к снижению активности Ферментного комплекса за счет элюции примесных белков, а снижение молярности этого же буфера ниже 0,12 М способствует разделению алкогольдегидрогеназы и пируватдекарбоксилазы (алкогольдегидрогеназа остается на колонке с адсорбентом), Для количественного определения тиаминдифосфата в биологических объектах ферментативным методом необходимо,50 5 16204 чтобы соотношение пируватдекарбоксилазной и алкогольдегидрогеназной активностей в ферментном комплексе составляло 1(0,15-0,5) при пируватдекарбоксилазнои активности не менее5 14,0 ед.акт./мг белка.Превышение указанных верхних пределов не приводит к существенному повышению чувствительности ферментативного способа определения ТДФ с использованием ферментного комплекса в биологических объектах по сравнению с применяемым соотношением пируватдекарбоксилазной и алкогольдегидро 15 геназной активностей, а снижение указанных пределов способствует резкому ослаблению чувствительности. Кроме того, уменьшение пируватдекарбоксилазной активности ниже 14,0 ед.акт./мг 20 белка также ведет к значительному ослаблению чувствительности ферментативного способа определения ТДФ с использованием данного комплекса в биологических объектах. 25Изобретение иллюстрируется примерами.П р и м е р 1. Подготовка исходного материала, выделение и очистка комплекса пируватдекарбоксилазы и ал когольдегидрогеназы. Берут 5 кг свежих пивных дрожжей БассЬагошусез саг 1 зЬег 8 епзз 7-9 регенерации, Свежие дрожжевые клетки многократно промывают холодной водой и центрифугируют 15 минут при 5000 я. Полученную пасто- образную массу используют для приготовления суспензии и экстрагирования белкового препарата. Для этого 400 г дрожжевых клеток смешивают с 1750 мл 40 водного раствора, содержащего 67 мл глицерина, 0,668 г ЭДТА, 13,2 г Г 1 а НРО 4, и 2,8 г (МН 4)БО. Приготовленную суспензию интенсивно перемешивают в течение 10 мин. Смесь охлаждают до 45 -2 С и обрабатывают ультразвуком при частоте 22 кГц в течение 20 мин, добиваясь полного разрушения клеток, способствующего максимальному выходу конечного продукта. Полученный дрожжевой экстракт центрифугируют в течение 30 мин при 4000 я, а затем 1 ч при 105000 д. Осевшие после центрифугирования субклеточные фракции удаляют, а на каждые 100 мл надосадочной жидкости при непрерывном перемешивании приливают по 55 мл ацетона, охлажденного до -20 С, не допуская нагревания раствора выше 0 С. После 83 615-минутного выдерживанця при этой температуре суспензию центрифугируют в течение 5 иин при 4000 я и осадок отбрасывают. На каждые 100 мл надосадочной жидкости повторно приливают по 10 мл ацетона, снижая температуру раствора до -2 фС. Через 15 иин экстракт центрифугируют, а конечный осадок быстро суспендируют в 400 мл 0,02 М трис-НС 1 буфера, рН 7,3, с 1 М ЭДТА и 5 мМ цистеин-гндрохлоридом. После 30-минутного перемешиваония при 0 С однородный белковый раствор подвергают фракционированию сульфатом аммония, добавляя 108 г сухого измельченного (ИН)БО, Через 1 ч смесь центрифугируют, осадок отбрасывают, а на каждые 100 ил надосадочной жидкости повторно вносят пог сульфата аммония в течение 20 иин при переиешивании. Высоленный белок собирают центрифугированиеи.Заключительную очистку осуществляют методом адсорбцнонной хроматографии на гидроксиапатите. Экспериментально подобрано значение р 11 и ионной силы уравновешивающего буфера, при котором ферментный комплекс не связывается адсорбентои и обнарун- вается в первых же фракциях элюирующего раствора, тогда как сопутствующие примеси все еще эффективно удерживаются на носителе. С этой целью белок (3 г) сульфо-аммонийной пасты диализуют в течение 4 ч против 20-кратного объема 0,12 М натрий-фосфатного буфера, рН 6,8, с 2 иМ Г 18+, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ ТДФ и 5 иМ цистеингидрохлоридом, а выпавший осадок удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость разбавляют исходным 0,12 М натрий-фосфатным буфером до концентрации белка в растворе 10 мг/мл, смешивают с 3-кратныи объемом уплотненного осадка гидроксиапатита, уравновешенного этим же буферои, и после 10 мин экспозиции при 4 С центрифугируют 10 мин при 12000 я, Надосадочная жидкость содержит смесь алкогольдегидрогеназы и пируватдекарбоксилазы. Для полноты экстракции адсорбент повторно промывают, белок надосадочной жидкости объединяют, осаждают (ЫН)БО (полное высаливание) и собирают центрифугированием. На данном этапе очистки (табл, 1) удельная активность пируватдекарбоксилазы возрастает в 2,9 раза (с 4,8 ед, акт.,мгдо 14,0 ед.акт./мг), а алкогольдегид" рогеназы - в 175 раза (с 1,2 ед.акт./мг до 2, ед,акт./мг) и является приемлемой для Ферментативного определе 5 ния содержания ТДФ. Соотношение пируватдекарбоксилазной (14 ед.акт./мг белка) и алкогольдегидрогеназной (2,1 ед.акт./мг белка) активностей в ферментном комплексе составляет1:Г,15 (табл. 1).Процесс выделения занимает 12 ч.П р и м е р 2. Получение апопируватдекарбоксилазы в составе комплекса и его стабилизация.15Получение апопируватдекарбоксилазы основано на способности холофермента легко диссоциировать в щелочной среде с освобожде .ем ТДФ и ионов Мя . Для удаления кофермента осаж 20 денный после фракционирования на гидроксиапатите Фегментный комплекс (680 мг) растворяют в 5 мл 0,01 М трис-НС 1 буфера, рН 9,0, с 1 мМ ЭДТА и 5 мМ цистеин-гидрохлоридом, выдер живают для полноты диссоциации при данном рН в течение 15 мин и наносят на колонку (5,4 Х 70 см) с декстрановым гелем ЗД,0 (Фракция до 50 мкМ), .уравновешенную исходным буфером. По мере выхода белка раствор собирают в объеме 30 мл. ТДФ элюируется позже, начиная с 40 мл, В таком состояниибез кофермента апофермент чувствителен к наличию с льфгидрильных реаген 35тов, ионов металла, воздействию рН,температуры и ионной силы буферного раствора, поэтому скорость тока жидкости через колонку должна быть достаточно высокой (36-48 мн/ч), аэлюируемый белок после выхода немедленно стабилизирован (способностьк рекомбинации апопируватдекарбоксилазы дрожжей сохраняется в 0,01 Мтрис-НС 1 буфере, рН 9,0 в течение3-4 ч). Бсе операции по выделениюапофермента и последующей защите от инактивации проводят при 4 С.Стабилизацию комплекса апопируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогена" зы осуществляют глицерином или сульфатом аммония в присутствии ионов Мя+. В первом случае значение рН элюируемого с колонки раствора апофермента снижают 0,05 М натрий-фосфатным буфером до 6,8, а затем сюда55 же вносят глицерин и 0,5 М МАЗО до конечной концентрации компонентов 367 и 0,02 М соответственно. Во втором - к белковому элюату при непрерывном перемешивании приливают равный объем 5,4 1 сульфата аммония в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 6,8, с 0,04 М Ме 80, после чего белок лиофилизируют на установке для сублимационной сушки при температуре -3 С и давлении 6 10 Па. Б 307-ном глицерине в присутствии Мя реактивация апопируватдекарбоксилазы с низкими концентрациями ТДФ и алкогольдегидрогеназная активность остаются высокими в пределах 1,0-1,5 недель, позволяя проводить серийные исследования уровня ТДФ в биологических объектах без ежедневной практики подбора необходимой концентрации белкаапофермента, как это наблюдается в случае работы с сульфо-аммонийными препаратами.11 иофилизированный из 2,7 М (ИН)ВОс 0,02 М МАМБО комплекс стабилен в течение года (табл. 2),П р и м е р 3. Модельная система количественного определения ТДФ в биологических объектах: в животных тканях, крови.С целью диагностики В-недостаточности с использованием ферментного комплекса животных за 12 ч до забоя лишают пищи, После декапитации животного исследуемые ткани быстро извлекают, очищают от оболочек: продавливают через пресс с диаметром пор 1 мм и гомогенизируют в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (7-9 движений) с 5 объемами охпажденной до 0 - 2 С 7%-ной трихлоруксусной кислоты. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, а осадок повторно перемешивают с 5 объемами 7 Е-ной трихлоруксусной кислоты при 0 - 2 С с поо :следующим центрифугированием. Полученную от двух центрифугирований надосадочную жидкость дважды обрабатывают 3 объемами насыщенного водного раствора эфира длч удаления трихлоруксусной кислоты. Конечное разведение для тканей печени, почек, сердца, равное 1:20, а мозга и мышц 1:10достигается внесением к безбелковому экстракту 0,05 М натрий-Фосфатного буфера рН 6,8, после чего отбирают аликвоты по 0,1 мл для рекомбинации содержащегося в тканях ТДФ с апопируватдекарбоксилазой фурментного комплекса. Рекомбийацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин, 162048335 Для этого к анализируемым аликвотамдобавляют по 0,1 мл 0,02 М МАМБО иО,1 мл раствора очищенного ферментного комплекса апопируватцекарбокси 5лазы с алкогольдегицрогеназой (200600 мкг белка), разбавленного до не"обходимой концентрации 0,05 М натрийфосфатным буфером, рН 6,8, Общийобъем доводят исходным 0,05 М натрийФосфатным буфером до 0,8 мл. По истечении времени инкубации в каждую пробу вносят по 2,0 мл 0,15 М натрийцитратного буфера, рН 5,9 и 0,1 мл0,2 М пировинограднокислого натрия.Реакцию запускают добавлением 0,1 мл0,5 мМ НАД Н, измеряя изменениеоптической плотности раствора первые 3 мин при,4 340 нм. По суммарнойвеличине спектрофотометрически регистрируемой оптической плотности(00) находят соответствующее ей значение точки на калибровочной кривой.Ее параметры, умноженные на исходное разведение ткани, соответствуют 25искомому значению концентрации общего ТДФ.Кровь отбирают из безымянногопальца обследуемых пациентов, в течение 8-10 ч до анализа не принимавших пищу. Для определения уровняТДФ 0,2 мл капиллярной крови смешивают с 0,4 мл охлажденного до 4 фС0,05 М натрий-фосфатного буфера,рН 6,8, содержащего 2 Х-ный гепарин.После 15-минутной экспозиции при40 С смесь кипятят 2 мин, центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин и отсюдаотбирают аликвоты по 0,2 мл для рекомбинации ТДФ исследуемых проб сапопируватдекарбоксилазой. Условияпроведения рекомбинации идентичнытаковым для животных тканей,Искомые значения точек для калибровочного графика находят в аналогич 45ных для рекомбинации исследуемых образцов крови или тканей условиях,используя вместо 0,1 мл тканевогоэкстракта или 0,2 мл крови известныеконцентрации (О 005-0 2 мкг) хромаУ У50тографически чистого препарата ТДФ,По получаемым при этом разностямэкстинкции восстановленного и окисленного НАД, регистрируемым первые 3 минпротекания сопряженной Ферментативной реакции реактивированной холопируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы дрожжей при 340 нм, строяткалибровочную кривую, откладывая по оси абсцисс используемые концентрации ТДФ, а по оси ординат соответствующие им значения экстинкции за вычетом контроля, фиксируюцего степень самопроизвольного окисления НАЛН в отсутствие ТДФ (см. Фиг, 1-3), 1".ри ферментативной детекции общего ТДФ в анализируемых пробах крови или тканей регистрируемые в эксперименте величины экстраполируют на калибровочную кривую, а затем на ось абсцисс с известными концентрациями ТДФ.П р и м е р 4, Интервал концентраций ТЛФ, в котором сохраняется линейность сопряженного процесса с использованием комплекса.Н 9 фиг. 1-3 представлены зависимости суммарной скорости сопряженного ферментативного процесса от концентрации ТДФ при различных полярных концентрациях предлагаемого комплекса в отсутствие (фиг. 1-2 а) и при добавочном внесении (Фиг. 1 и 2 б) коммерческой алкогольдегидрогеназы. Как видно из графиков, в исследуемом интервале концентраций кофермента, при содержании белка 0,18-0,60 мг, удовлетворительная линейность суммарной скорости процесса сохраняется до 0,3 мкг ТДФ. При более низком чем 0,18 мг содержании комплекса в силу недостаточной разности экстинкции между контрольной и опытной пробами в случае малых концентраций ТДФ снижается точность Ферментативного определения (см. таблицу 3). Концентрация комплекса 0,6 мг практически обеспечивает белковое насыщение и ее увеличение способствуетнепроизводительным затратам комплекса. Дополнительное внесение коммерческой алкогольдегидрогеназы (50 мкг на пробу) к комплексу не ведет к увеличению скорости (см. Фиг. 1-2) сопряженного процесса, свидетельствуя тем самым о достаточности Ферментативной активности алкогольдегидрогеназы дрожжей в составе комплекса. П р и м е р 5. Чувствительностьи точность определения,Согласно данным табл. 3 ферментативный метод количественного определения общего ТДФ с использованиемкомплекса позволяет фиксировать концентрации кофермента в дозе 0,005 мкг,а точность измерения составляет всреднем 1,96 Ж.12 1620483 Формула изобретенияСпособ получения ферментного препарата для количественного определения тиаминдифосфата. в биологических объектах, предусматривающий выделение пируватдекарбоксилазы из экстракта пивных дрожжей путем фракционирования ацетоном, фракционирования сульфатом аммония в интервале концентраций 44-533 насыщения и хроматографической очистки, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью расширения технологических возможностей способа, ускорения процесса и удешевления конечного продукта, совместно Таблица 1 Общая активность,ед.акт.Стадия очистки ПДК АДГ ПДК АДГ ПДК АДГ 6840 57000 22060 0,12 0,39 5,4 3,9 8400 17640 3950 0,47 2760 12,3 10,0 4,8 2300 13440 1,2 36,0 17,5 1428 2,1 14,0 680 9520 Таблица 2 Время хранения 1 сходиея реахтивация ало" Стабилияируицая смесь Нсходнвя ЛДГ Часыность 3 6 12 24 168 3 762,0 оо г,о 1 В отсутствие стабнли авторов - 0,0 М трио-НС 1 буфер, рН 92,100 98 92 74 6 20 2,1 2,05 1,9 1 1002 1 Исходный экстрактФракционирование ацетономФракционирова"ние сульфатомаммонияХроматографияна гидроксиапатите 2 После снияения рн0,05 М натрий-фосфатньм буфером до 6,8302-ный раствор глицерина в 0,057. Мнатрий-Фосфвтном буФере рН 6,8307-ный раствор глцарила с 0,02 ММ 8804рн 6,85302-1 ьЮ раствор глицрина с 1 мМ ЭДТЛ и5 мМ лнстеиигидрохлоридом, рй 6,8 6 0,02 М М 8804 в 005натрий-Фосфатиом буФере рН 6,87 После лиофилиаацп и2 7 М раствора (ЮЩЯр 1 6,8 с пируватдекарбоксилазой выделяют алкогольдегидрогеназу, при этом фракционнрование экстракта ацетоном проводят в интервале концентраций 35,5- 541,1% и. хроматографическую очистку проводят методом адсорбционной хроматографии на гидроксиапатнте в 0,12 М фосфатном буфере до соотношения пируватдекарбоксилазной и алкогольдегидрогеназной активностей в ферментном препарате 1:(0,15-0,5) и до величины пируватдекарбокеилазной активности не менее 14,0 ед/мг белка, а пируватдекарбоксилазу в составе препарата 15получают в виде апофермента,Удельная активность, Степень ед.акт.7 мг белка очисткиб 20483 оставитель А.Н.Семеновехред Л,Олийнык Корректор А.Осауленк Редактор М.Недолуженк ГКНТ СССР роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 1 Заказ 42 НИИПИ Го Тираж арственного комитета по 113035, Москва, Ж