Способ получения сульфонатов -аденозил -метионина

ОП ИСАИ И Е ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистических Республик(088. тен бликования описания 2807,7 Да Иностранец Альберто Фиеччстранная ФирмаЛимитед ПартнершипЛивио Камоззи энд К.,(71) Заявител 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУЛЯ-АДЕНОЗИЛ-Ь-МЕТИОНИНА ТОВ 2фокислоту, Г,сЗ- Я,й-З-бромкамфор-сульфокислоту, цистеиновую, бензол сульфокислоту, и-хлорбензолсульфокислоту, 2-метилбензолсульфокислоту 4-дифенилсульфокислоту, 1-нафталинсульфокислоту, 2-нафталинсульфокисту, 5-сульфосалициловую кислоту,ацетилбензолсульфокислоту, 1,2- -этандисульфокислоту, о-бенэолдисульфокислоту и хондроитинсерную кислоту, заключается в том, что к водному концентрированному раствору ЯАМ добавляют насыщенный растворкролоновой кислоты в воде или орническом растворителе, растворимом в воде, полученный пикролонат подвергают взаимодействию с раствором сульфокислоты НЯОаН, где В имеет указанные значения, или со смесью серной и упомянутой сульфокислот с последующим осаждением целевого про дукта растворителем, смешивающимся с растворителем, используемым на стадии образования сульфоната. пособа посульфона обла ние касается сых соединений -ноэил-Ь-метиониыми Фармакологически получение нений, расшив воздействия ло и" с в теза итнойфокис 0 Сущность предложенн способа получения сульфонатов еноэил- -Ь-метионина общей ФормулыЯАМ(нхэ ячгде ЯАМ - Я-аденоэил-ь-метионйн 1 х = О, 1, 2; и = 1,2; у =1,1,5,2,3,4, причем, если х = О, и = 1,2, у =1,5,2,3,4; х = 1, и = 1,2, у2; х = 2, и = 2, у .= 1, Н - радикал сульфокислоты, выбранной иэ группы, содержащей метансульфокислоту, этансульфоккслоту, 1-н-додекансульфокислоту, 1-н-октадекансульФокислоту, 2-хлорэтансульфокислоту, 2-бромэтансульфокислоту, 2-оксиэтансульфокислоту, 3-оксипропансульфокислоту, Е,й- Е,д-камфорсуль-. огоЯ-ад пи 15 гаИзобрете лучения нов натов Я-аде дающих ценн свойств ами,Цель иэобретения -ценных полезных соеди ряющих арсенал средст на живой организм. Это достигается путе ледник, основанного на реакции получения солей лот 11, Обычно органический раст ирают из группы, содержа одноатомные спирты, аце этилкетон, метилизобутил лацетат, тетрагидрофуранО 5 ц х х О ос с йЭЮ Х с с; ХО э ох Е Ы пб ОС1.1 й Эс э о й х 114Й х Ц 0 сд хсб х с 114 Цэо 1 Э К х х сх х Э с О Е л 1 С:; а сс ха х 1 О ; И х еЦФхо ц сох эОъ сЭ й1 Д х цб б чНОХ -сс к о л 1 ЦО о х х 1 о х 0 Ихо иаа,о х, И Сс -с х О о 1 о с 4+ И о ю к о ж 1О хе (б д1.1 Э б ЕОХ Х 1 Ц 1 Э хх с ос;х эо хо Ел с.: е 1 оЭ Э 1 д цхс;с О б ьб РхохО й О Р 1 О О О н ОЭ м О О с 1МИОо М03 И о х 1 о об о ах вой Х 1 о о н н фЮ М Р 15в ед нн 0ох аОД" 1юд 0 1 1 1 1 ф Е йО 1;Х ерхо Йхнн 1 Н 1 во Е х 1 1о ое мх О Оюцн чО Иу О 676169 Ц Ю Д И1 1Юон 1 лхб ц ох нхн ХЮдщОх:Хч ц 03 ен еою хххх о чцЕГ 4 0 л л И И Г" 1 О 3 1 О О 1 ь (Л л о х ох д Ф Щ 1 оХФ ФЦ Цй КЮх х ГЧ 1 ь гГ л ГЧч 1 1. оо 2 Ф Р Ц Ю х х о х о о х1 1ц ц ххононнФЛФахом 1 п и Ф о Е х 1 хн ХХДГО Охрахно ГЧ 1 Г О Е И о О к х Г 1 531 хдх оцх ао мхов+ И Ф о З Жх хао ноцн Ф О) Х Ф Ихны 1 Н 11 дФ хццх ФОО ияо Ф И г о Е ж Ф нй 11 ХГЧ ГдФ ЮИохО ГГ Ц 36 76169 Формула изобретения Составитель Г. Коннова Техред,. М.Петко Корректор С. Патрушева Тираж 512 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва Жд Раушская наб, д, 45Редактор Т, ЗагребельнаяЗаказ 4 359/5 3 Фили ал ППППатент, г, Ужгород, ул. Проектн ая, 4 Ь1. Способ получения сульфонатов Я-аденозил-Ь-метионина общей форму- лы Ягж (Н,ЯО, ) В(ЯО,Н) )где ЯАМ - Я аденоэил-Ь-метионин5х = О, 1, 2; и = 1, 2 у у = 1 1 5,2, 3, 4, причем, если х = О, и1, 2, у = 1, 5, 2, 3, 41 х =1, и = 1,2, у= 2; х = 2 и = 2,у = 1, к - радикал сульфокислоты, 10выбранной из группы, содержащей метансульфокислоту, этансульфокислоту,1-н-додекансульфокислоту, 1 н-октадекансульфокислоту, 2-хлорэтансульфокислоту, 2-бромэтансульфокислоту,2-оксиэтансульфокислоту 3-оксипропансульфокислоту, Ю,с 1- 6 с 1-10-камфорсульфокислоту, Ю,с 1- С,д-бромкамфор-сульфокислоту, цистеиновую,бенэолсульфокислоту, и-хлорбенэолсульфокислоту, 2-метилбензолсульфокислоту, 4-дифенилсульфокислоту,1-нафталинсульфокислоту, 2-нафталинсульфокислоту, 5-сульфосалициловую,п-ацетилбензолсульфокислоту, 1,2-этандисульфокислоту, о-бензолдисульфокислоту, хондроитинсерную кислоту,о т л и ч а ю щ и й с я тем, чток водному концентрированному раствору ЯАМ добавляют насыщенный раст" 30вор пикролоновой кислоты в воде илиорганическом растворителе, растворимом в воде, полученный пикролонат подвергают взаимодействию с растворомсульфокислоты ВЯон, где Е имеет 35укаэанные значения, или со смесьюсерной и упомянутой сульфокислоты с лоследуюшим осакдним целевого продукта растворителем, смешиваюшимсяс растворителем, используемым настадии образования сульфоната.2, Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что органическийрастворитель выбирают из группы,содержащей низшие одноатомные спирты,ацетон, метилэтилкетон, метилиэобутилкетон, этилацетат, тетрагидрофуран, 2-метоксиэтанол, 2-этоксиэтанол, диоксан, диметилформамид.3, Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что используют спиртовый раствор сульфокислоты.4. Способ по п.1, о т л и ч а ю"щ и й с я тем, что используют водный раствор сульфокислоты и сернойкислоты в смеси с равным объемоморганического растворителя, смешивающегося с водой,5. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что сульфонат осаждают добавлением органического растворителя, выбранного из группы, содержащей бензол, толуол, диэтиловыйэфир, диизопропиловый эфир, ацетон,метилэтилкетон, метилизобутилкетон,этилацетат, метилацетат, тетрагидрофуран, хлороформ.6, Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что двойную сольсульфокислоты и серной кислоты осаждают при добавлении низшего кетонаили алканола, полностью смешивающегося с водой.Источники информации, принятыево внимание при экспертизе1, Ленинджер А. Биохимия, Мир,1974 с. 626, 6761692-метоксиэтанол, 2-этоксиэтанол,диоксин и диметилформамид.Предпочтительно используют спиртовый раствор сульфокислоты, водныйраствор сульфокислоты и серной кислоты в смеси с равкым объемом органического растворителя, смешивающего 5ся с водой.Сульфокат обычно осаждают добавлением органического растворителя,выбранного из группы, содержащейбензол, толуол, диэтиловый эфир,дииэопропиловый эфир, ацетон метилэтилкетон, метилизобутилкетон, этилацетат, метилацетат, тетрагидрофу"ран, хлороформ,Двойную соль сульфокислоты и серной кислоты осаждают при добавлениинизшего кетона или алканола, полностью смешивающегося с водой,Известно, что ЯАМ представляет собой продукт исключительной важности 2 Одля большого количества биологических реакций Ферментативного трансметилирования.Однако большой проблемой, связанной с этим веществом, является егоисключительная нестойкость при температуре окружающей среды или вышеэтой температуры. Кроме того, способ его получения труден и малоосуществим в промышленных масштабах,Известны иссле,цовакия, направленные на стабилизацию ЯАМ до такой степени, чтобы сделать возможным его применение в областях биологии для того чтобы можно было получать солистойкие при нормальной температуреи и условиях влажности. В результате получены хпорид и сульФат БАМ,но они нашли применение только вкачестве реагентов в биохимии и толь Око в течение короткого времени, таккак даже в сухом состоянии их стойкость ограничена во времени при низ -ких температурах, .Кроме того, способы их получения полезны для получения этого вещества в малых количествах, но не для их получения впромышленных масштабах 1,Согласно изобретению новые солиЯАМ оказались необычайно стойкими 5 Опо времени при температурах до 45 Си их можно получать по новому способу, легко проводимому экономически в,годно в проьпдлекных масштабахи дающему высокие выходы.Содержание ЯАМ во всех кислотахданного изобретения остается неизменным даже через 360 дней при 45 Св сухом состоянии, Дне наиболеестойкие соли ЯАМ - хлорид и су:.ьфатизменяют содержание БАМ через30 дней при 45 С в сухом состояниисоответственно на 20 и 50; через.60 дней хлорид полностью разлагаетая, а сульфат содержит только 5начального ЯАМ,Способ получения новых солей сог.ласно предлагаемому изобретениювключает в основном следующие ста,ции:А Получают раствор, обогащенныйЯАМ, экстрагированием из природныхвеществ, содержащих его, или в результате ферментативного синтеза изаденозиктрифосфата (АТФ) и метиониНаоВ. Осаждают БАМ, присутствующийв отфильтрованном водном растворе,насыщенным водным раствором пикролоновой кислоты или растворами этойже кислоты в органических растворителях, смешивающихся с водой например в метиловом этиловом, пропиловом, изопропиловом, н-бутиловомили изобутиловом спиртах, или в ацетоне, метилэтилкетоне, метилизобутилкетоне, этилацетате, тетрагидрофуране, 2-метоксиэтаноле, 2-этоксиэтаноле, диоксаке ияи диметилформамид е,.В, Растворяют отфильтрованныйосадок в растворе одной иэ упомянутой кислот в спирте, например вметаноле этаноле, 1-пропаноле, 2-пропаноле, 1-бутаноле, 2-бутаноле,втор-бутаноле или 2-метоксиэтанолеили 2-этоксиэтаноле,Г, Добавляют раствор органического растворителя, "мешивающегосяс применяемым спиртом, например бензола, толуола, диэтилового эфира,диизопропилового эфира, ацетона,метилэтилкетона, ме.илизобутилкетона,этил- или метилацетата, тетрагидроФурана или хлороформа,Д, Отделяют органический растворитель и снова растворяют осадокв растворе кислоты, применяемой настадии В, в одном из растворителей,применяемых также ка стадии В, и обрабатывают раствор обесцвечивающимуглем,Добавляют к раствору органичеекого растворителя, способногоосаждать чистую соль, ЯАМ в хорошокристаллическом и легко Фильтруемомсостоянии. выбраккого из растворителе., указанных ка стадии Г,Первые две стадии способа получения двойных солей с серной кислотойидентичны,Последующие стадии можно осуществлять следующим образом:Ж, Растворяют отфильтрованныйосадок в смеси., содержащий равныеобъемные ",.асти растворителя, частично смешивающегося с водой, например;еилэтилкетока, метилизобутилкетон-, и-бутакола иль изобу=а.:ола, иводного раствора равной ",онцентрации (в г-эквивалентах) :;,1-ой из упо;.;якут.,й сульфокислоты н серной кислоты,3, Отделяют органический слой кдобавляют к водному ра:.твору кетогили спиртовый растворитель, полно,стью растворимый в воде.И. Снова растворяют осадок в 10-20-ном растворе кислоты, применяемой на стадии Ж в одном из спиртовых растворителей, применяемых на стадии В, и обрабатывают раствор обесцвечивающим древесным углем.К. Добавляют органический растворитель, способный осаждать чистый ЯАМ в хорошо кристаллизуемом и легко фильтруемом состоянии.В соответствии с одним из вариантов двойные соли получают путем подвергания простой соли полученнойв конце стадии В, следующим стадиямЛ. Снова растворяют осадок в водном раетворе (одинаковой нормальности) серной кислоты и кислоты, применяемой на ранней стадии В, и обрабатывают раствор обесцвечивающим древесным углем.М. Добавляют органический растворитель, способный осаждать чистую соль ЯАИ в хорошо кристаллизуемом и легко фильтруемом состоянии,Стадию А способа можно проводить разными путями, одинаково эффективными для получения концентрированного раствора ЯАИ. В примерах приведены способы получения новых солей данного изобретения.П р и м е р 1. К 90 кг дрожжей,обогащенных ЯАМ (6,88 г на 1 кг),фв соответствии с методом Шленка,добавляют 11 л этилацетата и 11 л водапри температуре окружающей среды,После энергичного перемешивания втечение 30 мин добавляют 50 л 0,35 н.серной кислоты, непрерывно перемешивая еще в течение 1,5 ч. После фильтрования и промывания водой получают 140 л раствора, содержащего4,40 г/л ЯАМ, что соответствует99,5 его количества в исходном материале. К полученному раствору приперемешивании добавляют раствор2,3 кг пикролоновой кислоты в25 л метилэтилкетона, После выдерживания в течение ночи осадок отделяют центрифугированием и промываютводой.Осадок растворяют при перемешивании при температуре окружающей среды в 6,2 л 1 н. раствора метансульфокислоты в метаноле. После отфильтровывания следов нерастворимого ма- .териала к раствору добавляют 50 л:ацетона. После полного осажденияосадка верхний слой раствора декантируют, а нерастворимый остатокпромывают небольшим количеством ацетона,Осадок растворяют в 25 л 0,25 н.раствора метансульфокислоты в метаноле, добавляют обесцвечивающий древесный уго,ь и раствор Фильтруют. К ьФильтрату добавляют 125 л метилизобутилкетона,Получают 1089 г кристаллическогои легко Фильтруемого осадка, растворимого в более 20 воды с образованием бесцветного раствора, Сольслабо растворима в обычных органических растворителях. Результатытонкослойной хроматографии показали,что продукт не содержит примесей,Аналитические данные приведеныв табл.1 и соответствуют соединению общей ФормулыС Н М О Я 4 СН О Я,Новое соединение идентифицируют5 по ферментативному способу, основанному на Ферментативном метилировании никотинамида и гуанидиноуксусной кислоты с помощь 1 о ЯАИПри полном повторении данной методики, но с применением н-додекансульфокислоты и 1-н-октадекансульФокислоты получают соли Формул1 Б 236 б 14 2625С Н МОЯ 4 СЫ 23 65 16383аналитические данные которых приведены в табл.2.П р и и е р 2. 1,15 кг пикролоновой кислоты, растворенной в 10 лизобутилового спирта, добавляют к70 л раствора, получаемого после лизиса дрожжевых клеток, при этом применяют исходные материалы и способ,описанные в примере 1,После выцерживания в течение ночиобразующийся осадок отделяют центрифу гиров анием,Осадок растворяют при температуре окружающей среды при перемешивании в 3,1 л 1 н, раствора этансуль 40 Фокислоты в этаноле. После фильтрования от небольшого количества нерастворимых веществ к Раствору добавляют 25 л диэтилового эфира.После отстаивания смесь Фильтруют и45 осадок промывают небольшим количеством эфира. Осадок растворяют в12,5 л .0,25 н. раствора этансульфокислоты в этаноле, добавляют обесцвечивающий суголь и смесь фильтруют.К Фильтрату добавляют 63 л бензола.585 г соли осаждают, Фильтруют ивысушивают. Полученное соединениерастворимо в воде более, чем на 20,и слабо раствсримо в обычных органических растворителях, Как показали результатй тонкослойной хроматографии соединение не содержит какихлибо примесей.Аналитические данные, показанныев табл,1, соответствуют продукту формулы С 1 Н 23 Ю 4 ЯОб 4 С 2 Н 6 ОзЯНовое соединение идентифицированотакже по Ферментативному способу,описанному в примере 1,При повторении методики данногоспособа, но при использовании 2 67617бромэтансульфокислоты и 2-хлорэтансульфокислоты получают соли формул4 яэ ь д5 т юАналитические данные для этихсолей приведены в табл.1П р и м е р 3 1,15 кг пикролсновой хислоты, растворенной в 12 лн-бутанола, добавляют к 70 л раствсра, образующегося при лизисе дрсжжЕвых клеток, полученного по способулизиса с применением такого же сырья,как н примере 1, После отстаиванияв течение ночи осадок отделяют центрифугиронанием. Осадок растворяютпри температуре окружающей среды приперемешинании в 3,1 л 1 н. раствораВ 10-камфорсульфокислоты н 1-пропаноле, Затем добавляют 25 л бензола,ВЫпанший осадок растноряют н 12,5 л0,25 н. раствора камфорсерной кислоты н 1-пропаноле и после добавления угля и фильтрования к Фильтрату 20добавляют 63 л ацетона,Получают 928 г соли. Соединениерастноримо в воде более, чем на20, и слабо растворимо н обычныхорганических растворителях.Результаты тонкослойной хроматографиипоказали, что соединение не содержиткаких:либо примесей.Аналитические данные табл.1 состветстнуют формулам продуктовС Н 2 эЬьОэЯ 4 С Н 1 ОЯ,Новое соединение идентифицировано также по Ферментативчому методу,описанному в примере 1.При аналогичном повторении метсдики способа, но с применением о"3-камфор-серной кислоты получаютсоль Формулы С Н И ОЯ 4 СН О ЯВт,аналитические данййе которой даныв табл, 1П р и м е р 4 Очистка специфического фермента.50 мл сефарозы полисахарида,производимого фирмой РЬаппас 1 а Р"пеСпещ 1 сабэ АВ Уппсала, Швеция) спекают и суспендируют н воде, а затем 45обрабатынают бромистым цианом поизвестному способу для связывания веществ, содержащих аминогруппы, нматрицы, содержащие полисахаридныйгель. К полученному гелю добавляютизбыток Б-лизина. После реакциигродукт несколько раэ промывают дистиллированной водой, буферной смесьюпри рН 8,5 и буферной смесью с рН4,", Затем гель используют для набивки колонки диаметром 1,5 см и высотой 30 см. Через колонку пропускаюбуферную см сь из 0,05 И триэтаноламина и 0,01 М серной кислоты (рНижения ло равивЕсия. В колонку помещают 2 мл дрожжевого экстракта, полученного звуковой обработкой или гомогениэацией,с помощью сухого льда и, возможно,после обогащенияспецифическим Ферментом. Колонку затем элюируют той же буферной смесью, которУю используют для достижения равновесия, а затем проводят распределение белков в элюате с помощью ультрафиолетовой спектрометрии, Одновременно определяют активность синтетазы в разных фракциях по способу Дж. А, Стекола, Мейойэ 1 п ЕцгутоРоду, т. 6, с. 566 (1963). Фракции, обладающие актив" ностью синтетаэы, собирают, Получен" ный раствор обладает активностью, превышающей активность неочищенного экстракта более, чем в 20 раз, Фермент можно далее концентрировать в этом растворе путем осаждения солями, органическими растворителями илин соответствии с известными способами концентрирования белковых раст"воровПолучение ЯАМ, 30 мп спеченного геля сефарозы активируют бромистым цианом или любым другйм известным способом связывания белков вматрицы полисахаридного геля. Кактинированному гелю добавляют 4 млраствора специфического фермента,очищенного по указанному способу исодержащего примерно 100 мг белка.Суспензию актиниронанного геля ираствор фермента перемешивают при4 С в течение 18 ч . Смолу промывают водой. Зти промывные воды содержат примерно 70 общей Ферментативной активности от начальной активности раствора специфического фермента. В результате инкубации сафарозы, полученной по упомянутомуспособу определения активности синтетазы, наблюдается, что примерно2 ОВ всей активности связывается сполисахаридом,Полученную сефароэу используютдля набивки колонки диаметром 1,5 сми высотой 20 см, Через колонку пропускают раствор, содержащий 0,675. Мтриэтанолаъин, 0,150 М сульфат магния, 0,.05 М АТФ, О 05 М м-метионин и 0,01 М КС 6 со скоростью 5 мл/ч при 25-27 сС.Элюат иэ колонки анализируют на содержание ЯАМ. Результат анализа показал, что выход составляет 30,Получение п-хлорбензолсульфоната.103 мл элюата, содержащего 6 г/лЯАМ, подкисляют серной кислотой дорН 3 и к полученному раствору добавляют при перемешивании раствор 2"3пикролоновой кислоты н 25 мл метилэтилкетона. После отстаивания в течение ночи осадок отфильтровывают и промывают водой.Осадок снова растворяют в 6,2 мл1 н. раствора п-хлорбензолсульфокис"лоты з 2-метоксиэтаноле,Затем добавляют 50 мл толуола,Выпавший осадок растворяют в 12,5 мл 0 25 н. раствора и-хлорбенэолсульФокислоты в 2-метоксиэтаноле,а поспе добавления угля и фильтрованияК фильтрату добавляют 60 мл хлороформа.Получают 1,43 г соли. Соединениерастворимо в воде более, чем на20, и слабо растноримо з обычныхорганических растворителях, Тонкослойзая хроматография показала, чтосоль не содержит каких-либо примесей,Аналитические данные, приведенные в табл,1, соответствуют соеди"нению формулыСНзИ 6 ОЯ ЗС 6 Н СВОЗЯ10Новое соединение йдентифицируется также по Ферментативному способу,описанному в примере 1.При аналогичном повторении методики данного способа, но с использованием п-ацетилбензолсульфокислоты, о"бензолдисульфокислоты, 4-бифенилсульфокислоты, 2-мезитиленсульфокислоты и 5-сульфосалициловойкислоты получают соответственно соли следующих Формул:С н И О 915 2 Ь Ь 5"Ъззб) СН И 60 з Я 3 С 12 Й 1 ООз 6, С 15824605Ъс Н, О Я, аналитйческие данные которыхприведены в табл.1,П р и м е р 5, Осадок, полученный после добавления пикролононой кислоты к 70 л раствора, как описано в примере 1, растворяют при температуре окружающей среды при перемешивании в 3,1 л 1 н. раствора 1,2- -этандисульфокислоты з метаноле,Затем добавляют 25 л ацетона.Выпавший осадок растворяют в 12,5 л 0,25 н, раствора 1,2-этандисульфокислоты н метаноле, а после добавления угля и фильтрования к фильтрату добавляют 60 л метилизобутилкетона. 40 Получают 546 г соли, Соединение растворимо более, чем на 20 з воде, и слабо растворимо в обычных органических растворителях. Результаты тонкослойной хроматографии показали, что соединение не содержит каких-ли" бо примесей 50Аналитические цанные, показанныев табл. 1, соответствуют продуктуформулы СН И ОЯ 2 СдН ОнЯз,Новое соединенйе идентифицируется также по ферментативному способу,описанному н примере 1,П р и м е р б. Осадок, полученный после добавления пикролоновойкислоты к 70 л раствора, описанного.н примере 1, растворяют при темпера 60туре окружающей среды и при перемеши"нанни в 3,1 л 1 н. раствора 2-оксиэтансульфокислоты з этаноле. Затемдобавляют 25 л метилизобутилкетона.Выпавший осадок растворяют и12,5 л 0,25 и, раствора 2-оксиэтансульфокислоты н этаноле и после добавления угля и Фильтрования к Фильтрату добавляют 80 л тетрагидрофурана аПолучают 632 г соли . Соединение растворимо з воде более, чем на 20, и слабо растворимо в обычных органических растворителях, Результаты тонкослойной хроматографии показали, что соединение не содержит каких-либо примесейАналитические данные, показанные з табл. 1 соответствуют продукту обще" ФормулыСН И ОЯ ф 4 С НО 4 ЯНовое соединение идентифицируется также по ферментативному способу, описанному в примере 1.При аналогичном повторении методики способа, но с применением 3- -оксипропансульфокислоты получают соединение ФормулыСНИ 605 Я 4 С Н О Э,аналитические данные которого принедены в табл1П р и м е р 7, Осадок, полученный после добавления пикролоновойкислоты к 70 л раствора, как описано н примере 1, растворяют при температуре окружающей среды и при перемеаивании з 3,1 л 1 н. раствора1-нафталинсульфокислоты в метаноле.Затем добанляют 25 л метилэтилкетона. Выпавший осадок растворяют з12,5 л 0,25 н, раствора 1-нафталинсульфокислоты в метаноле и последобавления угля и фильтрования Фильтрат добавляют к 70 л метилэтилкетона, Получают 717 г соли, Соединениерастноримо з ноде более, чем на20, и слабо растноримо в обычныхорганических растворителях, Результаты тонкослойной хроматографиипоказывают отсутствие каких-либопримесей.Аналитические данные, показанныез табл .1, соответствуют продуктуФормулы С и з ИО 5 Я ЗС, Нз 03 ЯНовое соединенйе идейтифицируется также по сФерментативному способу,описанному н примере 1.П р и м е р 8. Осадок, полученный после добанления пикролононойкислоты к 70 л раствора, как описано з примере 1, растворяют при температуре окружающей среды и при перемешинании з 3,1 л 1 н. раствора2-нафталинсульфокислоты з 2-пропаноле,добавляют 25 л диизопропилозогоэфира, Выпавший осадок растворяютз 12,.5 л 0,25 н. раствора 2-нафталинсулъфокислоты з метаноле и последобавления угля и фильтрования кфильтрату добавляют 70 л этилацетата,Получают 710 г соли. Соединениерастноримо в воде более, чем на 20, 6 7616940 45 5 О 3 о 0 ОЛ и слабо растворимо в обычных органических растворителях, Результатытонкослойной хроматографии для этого соединения показали отсутствиекаких-либо примесей.Аналитические данные, приведенныев табл.1, соответствуют соединениюформулы С НИ ОЯ 3 СОНВО 9 ЯНовое соединение идентифицируется также по Ферментативному методу,описанному в примере 1.П р и м е р 9. Осадок, полученный после добавления пикролонсвойкислоты к 70 л раствора как пока -вано в примере 1, растворяют притемпературе окружающей среды и приперемешивании в 3,1 л 1 н. раствсрабензолсульфокислоты в 2-бутаноле,Затем добавляют 25 л диизопропилсВого эфира. Выпавший осадок растворяют в 12,5 л 0,25 н, раствора бензолсульфокислоты в метаноле и пос"ле добавления угля и фильтрованияк фильтрату добавляют 65 л этилацетата.Получают 612 г соли, Соединениерастворимо в воде более, чем на20., и слабо растворимо в обычныхорганических растворителях. Результаты тонкослойной хроматографии дляэтого соединения показали, что соединение не содержит каких-либопримесей.Аналитические данные, показанныеВ табл,1, соответствуют продуктуФормулы С Н . К О Я ЗС,Н О ЯНовые соедйненйя идейтйфйцируются также по Ферментативному способу,:описанному в примере 1,П р и м е р 10. Осадок полу-.ченный добавлением пикролоновой кислоты к 103 мл раствора, как показанов примере 4, растворяют при температуре окружающей среды и при перемешивании в 6,2 мл 1 н, растворахондроитинсерной кислоты в метаноле,Затем добавляют 50 мл ацетона.Выпавший осадок растворяют в 25 мп0,25 н, раствора хондроитинсернойкислоты в метаноле и после добавления угля и фильтрования к 11:лвтрату добавляют 125 мл метилизобутилкетона,Получают 3,27 г соли, Соецинениерастворимо в воде более, чем на20 о и слабо растворимо в обычныхорганических растворителях, Резуль"тат . тонкослойной хроматографии по казали отсутствие каких-либо примесей.Аналитические данные, показанныев табл.1, соответствуют продуктуФормулы С Н К,О Б 4 СН 1.О. Я.Новое соединение идентифицируетсятакже по Ферментативному способу,описанному в примере 1,П р и м е р 11, Осадок, получен"ный после добавления пикролоновойкислоты к 103 мл раствора, как показано в примере 4, растворяют притемпературе окружающей среды и приперемешивании в 6,2 мл 1 н, раствора цистеиновой кислоты в 2-этоксиэтаноле. Затем добавляют 50 мл диметилацетата. Выпавший осадок растворяют в 25 мл 0,25 н. раствора цистеиновой кислоты в 2-этоксиэтаноле,а после добавления угля и Фильтрования к Фильтрату добавляют 125 мл метилацетата. Получают 1,53 г соли.Соединение растворимо в воде более,чем на 0, и только слабо растворимо в обычных органических растворителях, Результаты тонкослойнойхроматографии показали отсутствиекаких-либо примесей.Аналитические данные, поиведенные в табл 1, соответствуют продукту ФормулыС Н Н О Б4 С Н 7 ИОЯНовое соедийение йдентйфицируетсятакже по Ферментативному способу,описанному в примере 1,П р и м е р 12. Получение двойной соли ЯАМ с серной кислотой и,етансульфокислотой.103 мл элюата, содержащего 6 г/лЯАМ, полученного по методу примера4, подкисляют серной кислотой дорН 3, и к этой смеси добавляют приперемешивании раствор 2,3 г пикролоновой кислоты в 25 мл метилэтилкетона ,растворитель А),После отстаивания в течение ночиосадок отфильтровывают и промываютводой. Осадок снова растворяют в18 мл 0,1 н. раствора серной кислоты и метансульфокислоты и в 18 млметилэтилкетона (г.астворитель А) .После перемешивания и отстаиванияорганический слой отделяют, а водный слой взбалтывают с небольшим количеством метилэтилкетона до удаления последних следов пикролоновой .кислоты, После отлеления водногослоя д:Савл лют обе сцвечивающий угольи смесь Фильтруют, Получают 16,5 млводного бесцветного раствора, содержащего 33,.8 мл ЯАИ, что соответствует 90 ф ЯДм с цржащег ся в исходном растворе. Анализ с применениемтонкослойной хроматографии показал,что раствор :держит только ЯАМ.16 5 мл раствора выливают в 100 млацетона (растворитель В), После пере"мешивания и отстаивания жидкость отд ляют декантацией Осадок растворяютв 6,6 г 15"-ног раствора метансульФокислоты в метаноле (растворитель В) .После добавления обесцвечивающеьго угля и фильтрования раствор выпуувают в 25 мл этилового эфира (расБори":.егь ."., Смесь Фильтруют послеотстаивания и получают х:зрошо кристаллизуемую соль ( ,. г, следующегосостава: Я Ай МЯо " Н., Яс 4,А-.ЛИТИОЕсйид данные = ой "оли676169 13 При аналогичном повторении указанной методики, но с применением сульфокислот и растворителей, указанных в табл, 2, получают двойные соли, приведенные в табл, 2 с их аналитическими свойствами.При аналогичном повторении указанной методики, но с применением 3,3 г 15-ного раствора метансульфокислоты в метаноле на последующей стадии осаждения 25 мл диэтилового эфира (растворитель Г) получают 1,05. г солй следующего состава: ЯАМ ИБО НЯО, аналитические данные которых указаны в табл.3При повторении укаэанной методики, но с применением сульфокислот и растворителей, указанных в табл, 3, получают двойные соли, приведенные в табл. 3 с их аналитическими свойствами.П р и м е р 13. Получение.двойных солей ЯАМ с серной кислотой и 2-оксиэтансульфокислотой.Соль, полученную после первого осаждения БАМ 2-оксиэтансульфокислотой (см.пример 6), снова растворяют в 20 л раствора 0,1 н, серной кислоты и 0,1 н, 2-оксиэтансульфокислоты В метаноле (растворитель А),Смесь Фильтруют после добавления обесцвечивающего угля и к фильтрату добавляют 100 л метилизобутилкетона 1 О 20 ЗО Таблица 1 р аБ мокспри260 мкм(Нб н.) Основная Формула Анион най- дено най- вычисдено лено най- дено вычи слено вычис ленс МетансульФонат 10, 51 10,72 20, 30 20, 45 50, 3 50,96 188 СЬ НЭ 9 ЫЬОБ Додекан- сульфонат 555 561 1091 10,70 26,37 2668 98 р 7 Ь р 7 У7 р 127 Ь р 7 4,72 4,84 9,50 9,22 22,75 22,99 85 Этансульфонат 9 р 82 10 р 01 18 рб 2 19 р 06 47 р 12 67 р 55 175 С Н И О Я 2-Бромэтан- сульфонат 7,35 7,28 13,68 13,88 34,67 34 р 58 127 С Н ИО ЯВг2 Э 43 6 17 5 2-Хлорэтан- сульфонат 8,58 8,58 16,31 16,39 40,89 40,84 151 С Н ЫьО ЯСЯ 2 Э 4 Э ь 47 10-Камфор- сульфонат 5 97 6,33 11 р 53 12 р 06 29,52 30,06 55 7 б 21 5 5,14 5,11 9,81 9 р 75 24,02 24 р 30 89 8,91 9,30 17 р 25 17,73 43,82 44,19 163 1-Окт аде к ансульфонат Сз. Н 75 ЫЬ 07 Я о-Бромкамфор-сульфонат С Н И О Я Вг65 83 Ь 2 р 5 4 2-Оксиэтансульфонат , С Н И О Я 14(растворитель Б), Смесь Фильтруют после отстаивания и получают 587 г соли следующего состава:+ЯАМ НЯО 4 2 С Н,О 4 Я с аналитическими2 б 4данными, приведенными в табл,4,При повторении указанной методики, но с использованием 10 л раствора 0,1 н. серной кислоты и 0,1 н, раствора 2-оксиэтансульфокислоты в метаноле (растворитель А) последующее осаждение метилизобутилкетоном (растворитель Б) приводит к получению 505 г соли следующего состава, БАМ+ НЯО 4Н ЯО 4 С Н 04 Я аналитические даннйе которой приведены в тасл. 5При повторении упомянутой методики, но с использованием простой соли ЯАМ, содержащей анионы, указанные в табл. 5, и с использованием растворителей, приведенных в этой же таблице, получают двойные соли, указанные в табл, 5 с их аналитическими свойствами.При повторении этой методики, но с использованием 3,3 г 15-ного раствора п-толуолсульфокислоты в метаноле при последующей стадии осаждения 25 мл этилового эфира получают 1,18 г соли:БАМл НЯО 4 2 СНЗСЬН 4 ЯОЗН, обладающей свойствами, указайными для продукта примера 1.СЧ О с Гс мр хох 3 ЭЮ с1 о хо .6 Э Ц О О ОЪ 00 ЮО01г цх х;охФНЭ Йх Ц ЗД хфн хх на ное лан й; 1Н ЦФоМ х 1э оЙ х в х 1Фх цо 1 1 Э Ц М х ц НХХ Фно МФН 1ЭйвХФЫ 1Хх1 1 1,.3 р хф1 Я Щ. ф ( Жн О 1йх дфР 3 а ц хЧФВЕ 1 Е а 1 н ида 1 О; Х -ер 3 1 х 3 ф 3 х к х 1 ЭО гере 3 го ИХО хф Хо ЫООО ХО СЯ о о еа ф х о х о о х " Ф х о о Н р ф о" Зх о 1оц о,йЗе Ф 3 О гО гЯгоОкхМОИО БО б х о 1(3яйа во Х 1 ЕХ 1 1 1Ф хох но;х ФгХО МХНН 1 н ххцн оо,ф х дре