Способ определения активности ферментов, синтезирующих или разлагающих аденозинтрифосфат

, ЯЦ,107 6 А 00; С 12 И 9/1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЙЗ ОБРЕТЕНИ ЬСТВУПИ САНИ 3407340/28-1312.03.8230.01.84. Бюл. Р 43).Ю.Кулис, М.В.Песлякене;.А. Лауринавичюс и В.В.Кулене Институт биохймии АН ЛитССР есоюэный научно-исследовательсинститут прикладной энзимологии 577.15 (088.8) .1.Вове ).А., Со 1 очхсЬ Б.Р, апй вп , О. Ме 1 Ьос)в 1 п Епгущо 1 ору. - еш 1 с Ргевв, Меч ЮогК, 1955, р, 591.2,Бровко Л.Ю., Угарова Н.Н.Применение иммобилизированной феразы светляков для количестого определения АТФ и ферментов, еэирующих и разлагающих АТФ. - химия", 1978, т. 43, вып, 5, 98 - 805 (прототип).(22) (46) (72) Ь.-С 7 1) и Вс кий 53) (56) КаР 1 Асеа ч 1,(54) (57) 1.СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ, СИНТЕЗИРУЮЩИХ ИЛИРАЗЛАГАЮЩИХ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТ, включающий взаимодействие фермента ссубстратом в буферном растворе ирегистрацию изменения одного иэ параметров.системы с последующим определением активности фермента в зависимости от величины измеряемого параметра с помощью калибровочногографика, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью упрощения процесса, при взаимодействии фермента ссубстратом осуществляют электролизреакционной смеси в присутствииферментных электродов на основеглюкозооксидаэной или глюкозооксидаэной и Ъексокннаэной мембрань в.присутствии глюкозы и аденоэиндифосфата или аденоэинтрифосфатаи по уменьшению анодного тока определяют активность фермента.2. Способ по и. 1, о т л и ч а - ю щ и й с я тем, что используют 0,01 М трис-НС 1 буферный раствор, содержащий 2-5 мИ МбО .3. Способ по пп, 1 и 2, о т л ич а ю щ и й с я тем, что в качестве фермента используют пируваткиназу, в качестве субстрата - смесь 0,25- 0,5 мИ Фосфоенолпирувата, 0,25- 0,5 мИ аденозиндифосфата и процесс ведут в присутствии ферментного электрода с глюкозооксидазной и гексокинаэной мембранами.4. Способ по пп. 1 и 2, о т л ич а ю щ и й ся тем, что в качестве 1070166фермента используют ацетаткинаэу, в качестве субстрата - смесь 0,5- 1,0 мМ ацетатфосфата, 0,25-0,5 мМ аденозиндифосфата и 0,1 мМ глюкозы и процесс ведут в присутствии фер ментного электрода с глюкозооксидазной и гексокиназной мембранами.5. Способ по пп. 1 и 2, о т л и-.ч а ю щ и й с я тем, что в качестве фермента используют гексокинаэу, в качестве субстрата " смесь 0,25 мИ аденоэинтрифосфата и 0,1 мМ глюкозы и процесс ведут в присутствии ферментного электрода с глюкозооксидазной мембраной.1Изобретение относится к электро- химическим методам анализа, к способам измерения или испытания, использующим ферменты, конкретно оксидоредуктаэу и трансферазу, и может быть использовано для обнаружения киназ в растворах и для определения их активности.Известен колориметрический способ определения активности ацетаткиназы С 11 , включающий обработку исследуемого образца раствором, содержащим 3,2 МСНСООК, 1 М трис-НС 0,рН которого 7,4, 1 И МС 0, 3,5 М КОН, 28 н: НОННС 1, 01 М АТФ(натриевая соль нейтрализована с НСй), 1,25 ГеС 1 в 1 н. НС 1 (2 г РеС 1 6 НО в 100 мя 1 н, НС), 10 СС СООН. Цвет получа-. ют, добавляя 4.мл еС 0, оптическую плотность измеряют при 540.нм. АктивнОсть ацетаткиназы вычисляют из формулыЬ 38,7А/мг (мл)+мг(мл 1 где 2- полученная оптическая плотность при540 нм;38,7 - коэффициент;время инкубации,Емт мА 1 - количество ферментав мг или мл, внесенного в реакционнуюсреду.Однако в этом способе необходимо применять, только прозрачные,неокрашенные. образцы, аппаратураколориметрического определения дорогая, необходимо использовать много реагентов. Кроме того, метод необладает достаточной селективностью.Наиболее близким к предлагаемомуявляется биолюминесцентный способопределения активности ферментов,2синтезирующих или Разлагающих АТФ,включающий взаимодействие фермента ссубстратом н буферном растворе,измерение интенсивности биолюминесценции споследующим определением активностифермента в зависимости от интенсивности биолюминесценции с помощьюкалибровочного графика.В качестве буфера обычно используют 0,02 И трис-.ацетатный буфер,рН 7, 75, содержащий 2 мМ ЭДТА,в качестве фермента - люциферазу,а Ю качестве субстрата - люцифе рин Г 23 и 13.Однако в известном способе применяется дорогостоящая аппаратура, таккак концентрацию люциферина определяют спектрофотометром, а интенсивность биолюминесценции измеряют насконструированной в лабораторииустановке, содержащей кюветное отделение с дорогостоющими кюветами.Цель изобретения - упрощениепроцесса.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу определения активности ферментов, синтезирующих или разлагающих аденозинтрифосфат, включающему взаимодействиефермента с субстратом в буфернсмрастворе и регистрацию измеренияодного иэ параметров системы с последующим определением активностифермента в зависимости от величиныизмеряемого параметра с помощью 35 калибровочного графика, при взаимодействии фермента с субстратом осуществляют электролиз реакционнойсмеси в присутствии ферментных электродов на основе глюкозооксидазной 40 и .глюкозооксидазной и гексокиназноймембран и в присутствии глюкозы иаденоэиндифосфата или аденозинтрифосфата и по уменьшению анодноготока определяют активность ферментаВ качестве буфера используют0,01 М трис-НС 1 буферный растворсодержащий 2-5 мМ МЗО.В качестве фермента используютпируваткиназу или ацетаткинаэу в качестве субстратасмесь 0,25 - 0,5 мМ фосфоенол-.пирувата или 0,5-1,0 мМ ацетатфосфата, 0,25-0,5 мМ аденозмндифосфата и 0,1 мМ глюкозы и процесс ведутв присутствии ферментного электрода с глюкозооксидазной и гексокиназной мембранами.В качестве фермента может бытьтакже использована гексокиназа,тогда в качестве субстрата используют смесь 0,25 мМ аденозинтрифосфата и 0,1 мй глюкозы и процессведут в присутствии ферментного электрода с глюкоэооксидаз ной мембраной,На чертеже дан калибровочныйграфик зависимости ферментативнойреакции от концентрации.Способ включает операции погружения электрода с глюкоэооксидазной и гексокиназной или глюкоэооксидазной мембранами в термостати.руемый буферный раствор.и растворсубстратов, проведения электролиза,при котором регистрируют стационарный ток, вводят раствор ферментов,регистрируют уменьшение тока при0,6 - 0,7 В относительно Ас/АСВэлектрода в течение 4-10 мин, после чего расчитывают ферментативнуюактивность исходя из тангенса угланаклона кинетической кривой уменьшения тока в первые 4-5 мин. Калибрование электрода проводят послетрех определений активности.Способ основан на использованииферментных электродов.Для определения активности ферментов, разлагающих аденоэинтрифосфат, например гексокиназы, исполь"эуют глюкозный электрод, принципиальная схема изготовления которогоизвестна 31 . Он состоит иэ теплового корпуса, в который вмонтированы платиновый анод и А/АС 2 электрод сравнения. Анод покрыт двумямембранами: ферментной глюкоэооксидаэной и внешней диализной. Внутреннее пространство заполнено гелеобраэным электролитом,Для определения ферментов, синтезирующих аденозинтрифосфат, например пируваткиназы и ацетаткиназы,используют АТФ чувствительный электрод. Последний изготавливают такжепо известнойсхеме С 33, только анодпокрывают тремя мембранами: глюкозооксидазной, капроновой сеткой, порыкоторой заполнены суспензией гексокиназы, и внешней диализной.Способ определения основан наследующих ферментативных превращениях еПод действием глюкоэооксидазыокисляется глюкоза, образовываетсяНОе, а злектрохимическое окисление.последнего при +0,6 В относительноэлектрода сравнения насыщенный5 А/АСВ генерирует анодный ток:глюкозооксидаза глюкоза +0глюконолактон + ИО .При наличии гексокиназы и адеио зинтрифосфата параллельно протекаетфосфорилирование глюкозы с образованием аденозиндифосфата АТФ гексокинаэаглюкоза + АТФф 15.глюкозо-б-фрсфат + АДФ.Изменение концентрации глюкозыв отсутствии и при наличии в системе АТФ обуславливает разность в 20. значениях.величин анодного тока.,Угол кинетической кривой отражаетскорость ферментативной киназнойреакции разложение или образованиеАТФ).25 Пируваткинаэа при наличии в средесвоих субстратов - фосфоенолпируватаи аденозиндифосфата катализируетреакцию пируваткиназа 0,32105,5ф 10Гексокинаэа 4,3, "10 б; 6)ед/мл,19, 6)фед/мл;23, 4)сед/мл. 65 ФЕП + АДФ ф== пируват + АТФскорость которой пропорциональнаактивности фермента, выраженнойв ед/мл.Из экспериментально получаемой.величины скорости уменьшения тока( Ь 1 ан нА/мин ) и ответа АТФ -чувствительного электрода на стандартную концентрацию АТФ (0,1 мМ)вычисляется скорость ферментативнойреакции (скорость образования АТФ 40 мкмоль/мин 1 и удельная активностьпируваткинаэы в ячейке. Из построен-.ного калибровочного графика (концентрация фермента - скорость ферментативной реакции можно высчитать оп"ределяемую активность ферментногопрепарата (Е/мг белка 1 .Ацетаткиназная реакция аналогичнапируваткинаэной, только в качестведонора фосфатной группы выступает 50 ацетатфосфат. Определение ферментатив.ной активности аналогично.Для определения ферментативнойактивности,гексокиназы используетсязначение ответа д 1(нА) глюкозного 55 электрода на 0,1 мМ глюкозы.При определении активности в реакционную смесь вводят фермент сактивностью в определенном интерва- ле1070166 50 55 пируват + АТФ ФЕП + АДФ 15.10 мкмоль/мин А = 1 210 2 мг 0,75 Е/мг белка. Активность вычисляется из данныхэксперимента, т,е. из угла наклонакинетической кривой изменения тока.Это связано с тем, что в данных интервалах активности ферментов наблюдаются прямолинейные зависимостискорости ферментативной реакции отконцентрации фермента. Поэтому определение активности возможно толькотогда, когда активность исследуемыхкиназ находится в укаэанных интервалах.Для этого исследуемые ферментныерастворы в необходимых случаях разбавляют до нужной концентрации,обеспечивающей соответствующую активностьПреимуществом предлагаемого способа является значительное упрощение процесса по сравнению с извест,ным, так как он основан на использовании более простого оборудования,не требует дефицитной импортной аппаратуры, кроме того, обеспечиваетвозможность автоматизации процесса,что расширяет его технологическиевозможности.П р и м е р 1. Определение ферментативной активности пируваткиназы "Реанал".В ячейку помещают 0,01 М трис-НС 1 буфер, .2 мМ МфО, 0,25 мМАДФ и 0,25 мМ фосфоеыолпирувата,В полученный раствор при 25 С погружают ферментный электрод с глюкозооксидазной и гексокиназной,мемб.ранами, подключенный к полярографу.Рс самописцем. Затем добавляют 0,1 мМ глюкозы. Общий объемраствора в ячейке составляет 10 мл.Начинается ферментативное окисление глюкозы с последующим электрохимическим окислением на Р 1 выделяющегося Н,Опри потенциале 0,6-0,7.В относительно насыщенного электрода сравнения Ж/АС 6 и генерациейанодного тока 45 глюкоза + 0 - .= глюконолактон + Н С,НО - О + 2 Н + 2 е Записывают стационарный ток в течение 1 мин. Вводят 9,68 мкг исследуемого фермента - пируваткиназы (ПК 1 . Последняя при наличии в среде субстратов - аденозиндифосфата (АДФ и фосфоенолпирувата ФЕП катализирует реакцию скорость которой пропорциональна активности исследуемого фермента.Сопоявлением в растворе аденозинтрифосфата (АТФ) начинается реакция фосфорилирования глюкозы 65 глюкоза + АТФ -глюкозо- фосфат + АДФ.Следовательно, уменьшается концентрация глюкозы в растворе и уменьшается анодный ток, Самописец регистрирует скорость уменьшения анодного тока в течение 4 мин, которая составляет 0,5 нА/мин (ьЭ).Аналогично измеряют д при других концентрациях фермента ПК, чтобы получить статистически достоверную величину определяемой активности (19,36, 29,04; 51,04; 73,04; 85,0;99,5 и 120,0 мкг в 10 мл раствора.Полученные величины ьЗ приведены в табл. 1.Для вычисления скорости ферментативной реакции устанавливают еще величину уменьшения тока при использовании стандартного раствора, содержащего 100 мкМ АТФ в 1 л (ответ электрода на 100 мкМАТФ).Затем вычисляют скорость ферментативной реакции которую выражают в мкмоль/мин в объеме ячейки 10 мл удельную активность фермента в 1 мл, которую выражают в ед/мл, и удельную активность фермента ПК (Е/мг белка).Расчеты величин скорости ферментативной реакции100 мкМ - 81,5 нАХ - 0,5 нА/минХ = 0,6 мкМ/мин в 1 л) 0 Таким путем получают скоростьреакции в объеме 1 л. Отсюда следует, что скорость реакции в объеме10 мл 0,6 10 мкмоль/мин, а удельная активность ПК в 1 мл. - О,бхх 10ед/мл.Аналогично вычисляют эти параметры для других концентраций ПК, которые приведены в табл. 1.Расчеты удельной активности фермента ПК в Е/мг белка. Строится калибровочный график зависимости ферментативной реакции от концентрации(см.чертеж),Видно, что за пределами указанного интервала значений активностиконцентрации фермента) изменениескорости ферментативной реакции больше не фиксируется (на графике посление две точки 1. Поэтому этиконцентрации нс могут быть учтеныпри расчете определяемого параметра.Для расчета активности фермента изтангенса угла наклона берут любыедве точки калибровочной кривой,полученной в интервале концентраций 9,68 - 85,0 мкг в 10 мл раствора.7 10701 Аналогично, исходя из других концентраций и величин скорости фермен- тативной реакции, получают следующие активности: 0,62, 0,75, 0,80 и 0,78. Средняя достоверная величи- на, полученная при использовании 5 пяти концентраций, составляет 0,71 Е/мг белка что совпадаетс величиной, вычисленной из тангенса угла наклона калибровочной кривой).П р и м е р 2. Определение фер ментативной активности пируваткинаэы КосИ- Ьф 1 1 аЬФерментативный электрод с глюкоэооксидаэной и гексокиназной мембраной погружают в 0,01 М трнс-НС с 2 мМ МЭО буфер,в качестве субстрата берут 0,5 мМ АДФ и 0,5 мЕ фосфоенолпирувата, 0,1 мМ глюкозы при 25 С. Записывают стационарный ток в течение 1 мин, вводят раствор 0,32.10ед/мл пируваткинаэы, после чего записывают уменьшение анод- ного тока в течение 4 мин из-за продуцирования в системе АТФ.Активность пируваткиназы вычисляют аналогично примеру 1.Экпериментальные данные приведены в табл. 1.П р н ме р 3,Определение Ферментативной активности ацетаткинаэы"Сигма".Ферментативный электрод с глюкоэоооксидазной и гексокиназной мембранами погружают в 0,01 М трис-НС 1 с 4 мМ МФО буфер, в качестве субстрата применяют 0,5 мМ АДФ и 1,0 мМ-ацетатфосфата, 0,1 мМ глюкозы нри 25 фС. Записывают стационарный ток в течение 1 мин, вводят раствор 5,510 ед/мл ацетаткиназы, после чего записывают уменьшение анодного .тока в течение 4 мин из-за 40 продуцирования в системе АТФ. бб Активность ацетаткиназы вычисляют аналогично примеру 1.Экспериментальные данные приведены в табл. 2.П р и м е р 4. Определение ферментативной активности ацетаткиназы ВНИИ прикладной энзимологии.Ферментативный электрод с глюкозооксидаэной и гексокинаэной мембранами погружают в 0,01 М трис-НСР с 4 мМ МЗО буфер, в качестве субстрата применяют 0,25 мМ АДФ и 0,5 мМ ацетатфосфата, о,1 мМ глюкозы при .25 С. Записывают стационарный ток в течение 1 мин, вводят раствор 1 б,б 10ед/мл ацетаткиназы, послечего записывают уменьшение анодноготока в течение 4 мин из-за продуцирования в системе АТФ.Активность ацетаткиназы вычисляют аналогично примеру 1.Экспериментальные данныеприве-.дены в табл. 2.П р и м е р 5. Определение ферментативной активности гексокиназы.Ферментативный электрод с глюкоэооксидаэной мембраной погружаютв 0,01 М трис-НСФ с 5 мМ МЗО буфер, в качестве субстрата применяют0,25 мМ АТФ и 0;1 мМ глюкозы при25 С. Записывают стационарный токв течение 1 мин, вводят раствор4,310 ед/Мл тексокиназы, послечего записывают уменьшение анодноготока в течение 4 мин, которое имеетместо из-за фосфорилирования глюкозыАТФ, каталнзируемого гексокнназой.Активность гексокинаэы вычисляют аналогично примеру 1.Экспериментальные данные приведены в табл. 3,Из табл. 3 видна линейная зависимость скорости уменьшения концентрации АТФ от количества введеннойгексокинаэы.По сравнению с известным предлагаеьий способ определения активности ферментов, синтезирующих илиразлагающих АТФ, является простым,так как отсутствует необходимостьвыделения люциферазы и использования специальной люминесцентной аппаратуры, которая не выпускаетсяв нашей стране. При этом значительно ускоряется процесс определения,так как отсутствуют операции предварительной обработки образцов иприготовления реагентов.Кроме того, расширяются технологические возможности определения,так как .процесс определения можнопроводить непрерывно, например, входе бносинтеза ферментов, определение легко автоматизировать. Приодной заправке электрода гексокинаэной в течение трех дней можнопроанализировать около 1000 образцов. Перемонтаж электрода занимаетоколо 20 мин, а в случае измеренияактивности гексокинаэы, где используатся ферментативная глюкозооксидазная мембрана, электрод можноиспользовать в течение трех месяцев.л О О м мо ос ЦЕ о а Я Ф Х Ц Уо Ю н ю 9 Э О хйЭх м яхх ЭЦЦ хее ж аа хнне 1 с 311О1 Д Фн Оохиехы093Ц 9 сОдигаднххн ЭЭЭЭ н цив еххо ЦООО ИМ 8 Ю Ос О хх 14 й 1- ю " д 1 сХ 0,1 -Ц а фх О ХО1:;х щх 11х 1О1Ф 1хх х161 Э1 хл ЦЭ счЦсо Ф ОВ,рХ Е 16 1й й, 1 Хн1 Фдо 1.Н Ю 1 О111111 ФО хах хвх х-.3х ддЭЦЦОнного1 РсОКОХЭЕ 1 о2 аоееыщдх,ахах-41 1х 1 СЧ 1с 1 1 Ю о 1 лсх 1 Ю Ы "е 11Х Ох дцНО со ЭЕоХЫС, 0 а Фхх693хФ ЦЮхОд ЬСОх щ щдХ 1 1ихс 21Заказ 11643/27 Тираж 522 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретенийи открытий113035, Москва,. З"35, Рауюская наб., д.4/5 Количество ГК в ячейкемкг ч,мкмоль/минв 10 мл%Определение активности гексокиназы ГК 1 Филиал ППП фПатентф, г.Ужгород, ул.Проектная,4