Способ получения литических ферментов

Союз Советскик Социалистических РеспубликОПИСАНИЕ 1 ч 59470ИЗОБРЕТЕН ИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ 61) Дополнительное к авт. сзпд-ву - (22) Заявлено 28.09.73 (21) 1962088/1 о 1) Ч.Кл. С 12 с присоединением заявк Государстееннын комитет(23) Приоритет -143) Опубликовано 30.06,Совета Министров СССРпо делам изооретений,53) УДК 57.5Бюллете2 и открмтий бликования описания 06) Дат 2) Авторы изобретения Бабенко и Е. Ф, Григо нкаренко, Ю. 71) Заявитель Трудового Красного Знаменерситет имени 300-летияУкраины с Россией непропетровскии ордена государственный уни воссоединения54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТ 10,0 5Соевая мукаГлюкозаАзотнокислый калийДвузамещенный фосфонокислый калий акапливаются в культуральоторая после удаления мицеованных остатков соевой муолучения фермента. Культивированиеосуществляют на,среника углерода и азотвенно глюкозу и соевных солей - азотнокщенный фосфорнокисуказанные компоненколичествах, г/А: ферментов стве источ- соответст- минеральи двузамеПри этом следующих продуцента де, где в кач а использую ую муку, а и ислый калий лый калий. ты вводят в Изобретение относится к микробиологической промышленности, точнее к способу получения литических ферментов,Известен способ получения литических ферментов путем культивирования актиномицетов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и индуктор, с последующим выделением фермента из среды культивирования, например, осаждением сульфатом аммония.Предлагаемый способ позволяет получить высокоактивные ферменты широкого спектра действия при незначительных затратах на его получение.Достигается это тем, что из актиномицетов используют актиномицеты, относящиеся к виду гес 11 епз 1 з. При этом из актиномицетов вида гесйепз 1 з используют штамм айаг. 1 уЫсцв 2435, а в качестве индуктора синтеза фермента используют микроорганизмы вида Яарйу 1 ососсцз ацгецз, в частности штамм 142 а. Выделение фермента из среды культивирования целесообразно осуществлять сульфатом аммония при насыщении его до 40%.10 Сущность предлагаемого способа заключается в том, что в качестве инокулята используют блоки семисуточной культуры продуцента, выращенного на твердой среде Чапека. Выращивание продуцента ведут в усло виях глубинного культивирования при активной аэрации при 28 - 30 С в течение 2 - 3 суток.Ферменты нной жидкости, к20 лия и неиопользжи служит для п Очищенный ферментный препарат получают высаливанием при 0,4% насыщения куль туральной жидкости (МН,),50. Полученнаятаким способом фракция белка практически свободна от примеси протеолитических и амилолитических ферментов. Белковый осадок промывают в ацетоне, подсушивают, распвоз 0 ряют в буферной системе, подвергают диализу против растворителя. Диализат высушивают,при 0 под вакуумом.Получаемые таким способом литическиеферменты характеризуются устойчивостью вшироком диапазоне рН среды: 4,5 - 9,5 (оптимум 7 - 8), активны при 25 - 40 С (оптимум37 С). Длительно сохраняют активность при+4 С и при нагревании до 60 С (в течение30 мин),Используемый штамм Ас 1 погпусев гесИепвз аг. у 1 спв 2435 выделен из суглинистойпочвы Днепропетровского ботанического садапутем культивирования на селективной среде,содержащей клетки 51 я рчуо сосспз ац гецз142 а в качестве единственного источника 15углеродного и азотгого питаИя,и.сет с,чедующую характеристику,Морфология.Диаметр воздушного мицелия 0,7 - 0,9 мк,Спороносцы короткие, неспиральные, почти 20прямые, у,молодой культуры чуть волнистые,,расположены скученно, метелкой, Спорыовальные, оболочка гладкая. Воздушный мицелий серо-зеленоватый, окрашиваются колонии, но не среды. 25Окраска субстратного мицелия более интенсивная, чем у воздушного.Культуральные признаки.Среда Чапека: рост обильный, колонии сероватые, поверхность бархатистая, 30Крахмально-аммиачная среда: рост хороший, колонии зеле;овато-серье с желтоватымоттенком.Среда Гаузе 1 с минеральным источникомазота: рост хороший, колонии бархатистые, 35воздушный мицелий серо-зеленый, субстратный - серо-коричневый.Среда Гаузе 11 с органическим источникомазота: рост хороший, воздушный мицелий серо-зеленый, субстратныи - красно-коричневый. Бурое вещестзо не образуется.МПА, Дрожхкевой агар с мальтозой: ростобильный, колонии буро-зеленоватые, Воздушный мицелий серо-желтоватый,Полусиптетическая среда для глубинного 45культивирования пэодуцента, обеспечивающая высокий выход литического комплекса:соевая м;"ка - О г/л, К Оз - Осо гл, глюкоза - 5 г/л, К,НРО., - 0,1 г, клетки индуктораЯ 1 яэ. япгецв 142 а. 50Мицелий на данной среде образуется,в виде спутанных клубков нитей с небольшим количеством разветвлений,Физиологические свойства.Жеятнпя разжижяется быстро, молоко 55,пептопиз:руется, Кряхэал гдролизуетсяотносительно слабо. Нитраты восстанавливаются, тирозиназа не образуется. На клетчатке рост есть. Хорошо усваиваются практиче-.ски все сахара, но их присутствие в среде в 50значительных,количествах снижает синтез литических ферментов. Растет в пределах 14 -45 С (оптпмум 28 С). Синтез литическихферментов .нгибируегся Уп+ - , Сп+, Мп,Ре+; активируется Са ч+, Мо. 65 Продукция ферментов возможна в диапазоне рН среды от 4,5 до 9,5; оптимум 6,0и 9,0.Слабый антагонист. Незначительно подавляет рост отдельных грамположительныхбактерий и дрожжей, совершенно не угнетаетграмотрицательные формььПродуцируемые ферменты глубоко лизируют клетки организмов, относящихся к родам Чаруососсцв, Юрососспз, Мсгососспв,Вас 1 пв, Евс 1 егс 1 сае, За 1 гпопе 11 ае, ИЬгоСогупеЬяс 1 ег 1 цгп, Басс 1 агогпусев, Япкозасс 1 аг;пусез, СапсЫа,С помощью данного штамма возможноосуществлять направленный синтез, т. е, полуцать ферменты, обладающие определенными заранее заданными литическими свойствами, благодаря введению в среду требуемого индуктора,Способ поясняется следующими примерами,П р и м ер 1. Среду Л 6, содержащую в1 л дистиллированной воды 0,1 г К,НРО0,5 г К 1 ЧОз, 5 г глюкозы и 10 г соевой муки,засевают культурой продуцента блоками 7 -10 суточного штамма Ас 1 погпусев гес 1 епввайаг. утсцв 2435, выросшего на твердой средеЧапека. В среду одновременно с,посевнымматериалом вносят клетки индуктора - проявтоклавированную взвесь Яар 1 у 1 ососспвацгецз 142 а, содержащую 15 108 кл/м г.Взвесь добавляют в количестве 0,1 мл на 1 млсреды.Культивирование велось при активной азэации и перемешивании среды,при 27 - 28 Св течение 3 суток.После окончания инкубации культуральную жидкость освобождают от мицелия и неиспользованных остатков питательной средыдентрифугированием при 6000 об/,ин в течение 15 - 20 яин.Прозрачную культуральную жидкэсть, содержащую сырой литический,фермент, насыщают до 0,4 сернистым аммонием; полученьп солевой раствор оставляют при 4 С на16 - 18 час для формирования осадка. Осадоквыпавшего белка собирают фильтрованиемпод вакуумом (лри пониженной температуре),промывают холодным ацетоном, подсушивают до удаления ацетона и растворяют в аце.атном буфере рН 5,5 (0,1 М), взятом в количестве 0,1 от исходного объема культуральнойжидкости, Нерастворимый осадок отделяют в-ечение 10 мин центрифугированием при5000 об/мин.В полученном растворе белка определяютлитическую активность.К 2 мл взвеси живых клеток 51 ар 1 уососсцз ацгецв добавляют 1 ял ферментного раствора белка, На ФЭК-М при желтом светофильтре измеряют исходную плотность суспензии (не должна превышать 2), затемвзвесь термостатируют при 37 С в течение35 час и снова измеряот плотность раствора.Эффективность лизиса определяют по глуби59470 ской активности Таблица 3ПлотностьГлуконечного , бина раствора,лизнОД са % Плотность исходного раствораОД Время реакции, час изирчеглаякультура Таблн 1 а ПлотностьГлуконечногобина раствораЛизи(ОД)о,Время Плотность реак- исходного ции,раствора час(ОД) Лизируемая культураЕ. со 1 76,6 67,6, 2,3 66,016,0 65,5 12,3 42,02,5 17 6, 6,не лизиса исходной взвеси за 3,5 час, т. е, посоотношению плотностей чз исходном и конечном растворе, выраженном в процентах. Литическую активность данного фермент- ного раствора аналогичным образом исследуют и в отношении ряда других микроорганизмов,Результаты этих исследований представлеы в табл, 2. Глубина лизиса живых клеток Кар)1. ацгецз принята за 00%. 8 арп. ацгепзРрососсцз зр.СогупеЬас 1. гр 11 егасБас. зпо 111 з ЯН оюВагпопе 1 а а 1:дпдгг гпВас. зц 511 з (8. форма)Вас. исогез Мусгососспз руо:епезВас. гнездаег 1 цп. Вгцсе 11 а ЬгопсЫзер 1 саМ.узосесцепяВдгспд пса,П р и м е р 2, К среде Л 6 в качестве индуктора добавляют прогретую взвесь клеток Васцз гпусоЫез в количестве 0,1 мл на 1 мл среды. Выращивание и обработку культуральнойжидкости ведут, как указано в примере 1,Литическую актив.ость ферментного раствора белка проверяют з отношении живых н прогретых клеток Я 1 ар гососсцв ацгецз и Васцв гпусоЫез.Результаты представлены в табл. 3,где гоказана зависимость в сравнении с данныимн табл. 2 примера 1) лнтичеот природь индуктора. Таким образом, применение в качестве индуктора Яари ацгецз обеспечивает шнрокпй спектр литической активности ферментов. Вас. гпусос(ез л 1.зируется этим ферментом на 80% по отношению к стафилококку. Использование клеток других микроорганизмов в качестве индуктора,стимулирует синтез ферментов с целенаправленным спектром действия. йоомгча изобретения 1. Способ получения литических ферментов путем культивирования актиномицетов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и индуктор, с последующим выделением фермента из среды, например, осаждением сульфатом аммония, отличающийся тем, что, с целью получения более активных ферментов и с более широким спектром действия, из актиномицетов используют актиномицет, относящийся к виду гес 11 епз 1 з.45 2. Способ по и. 1, о тл и ч а ю щ и й с я тем,что нз актиномицетов вида гес 1 епй использугзт ц.та.,м .,аг М 1 сцз 43 о.50 3. Спосоо по пп, 1 - 2, отличающийся тем, что в качестве индуктора используют микроорганизмы, относящиеся к впду Яару осОссцз ацгец 4. Способ по пп. 1 - 3, о тл и ч а ю щ и й с ятем, что .1 з вида 5(арЛуососсцв аш.ецв используют штамм 142 а,60 5. Способ по пп, 1 - 4, отл и ч а ющ и й сятем, что з качестве источника углерода и азота в среде используют соответственно глюкозу и "оезуо му; у, а из солей - азотп,.кис лый калий и дзузамещенный фосфорнокис518470 Соевая мука 10Глюкоза 5Азотнокислый, калий 0,5 Составитель М. ЛаринаТехред Т. Курилко Редактор Е. Дайч Корректор В. Гутман Заказ 837/1070 Изд,1537 Тираж 575 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Тип. Харьк. фил. пред, Патент лый калийпри этом указанные компонентывведены в следующих количествах, г,л: Двузамещенный фосфор нокислый калий 0,16. Способ по пп. 1 - 5, отл ич ающи й сятем, что при выделении фермента из среды 5 сульфатом аммония, его вводят до 40% насыщения.