Способ получения амидов

/06 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(71) Хидеаки Ямада иКабусики Кайся (ЛР)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕН Нитто Кагаку Коги у Нагасава 5, кл. С 12 Р ИЯ АМИДОВ Р)3/02 Изобретение относится к способу гидратации нитрилов с их превращением в соответствующие амиды действием нитрилгидратазы, производимой микроорганизмом. Более конкретно,.настоящее изобретение относится к способу получения амидов биологическим путем, характеризующемуся используемым микроорганизмом и способом образования нитрилгидратазы.Изобретение создано на основе того открытия, что особый штамм рода Йпобососсцэ, а именно, штамм 1-1 вида гпобосЬгооэ не образует нитрилгидратазу в культурной среде, содержащей ион железа, но образует нитрилгидратазу в культурной среде, содержащей ион кобальта, и образующая нитрилгидратаза может использовать в качестве субстрата ароматический нитрил с его превращением в амид.Соответственно гпособ получения амидов настоящего изобретения является способом получения амидов биологическим путем, в котором нитрил гидратируют в соответствующий амид действием нитрилгидратазы, образованной микроорганизмом, и(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способов получения амидов биотехнологическим окислением нитрилов, Алифатические, ароматические или гетеро- циклические нитрилы помещают в среду, в которой культивируют штаммы-продуценты нитрилгидратаэы ЙЬодососсэ гпобосЬ оцуп 1-1 (РЕЯМ ВР) или АТСС 33278, или АТСС 33025. Процесс ведут при 10-30 С и рН 7,0 - 9,0 в присутствии солей Со, взятых в количестве 5-15 мг/л в пересчете на СоС 2, 3 з,п. ф-лы. способ характеризуется тем, что укаэанную нитрилгидратаэу получают культивированием микроорганизма вида РЬобососсцэ гЬо(1 осЬгооэ в присутствии ионов кобальта.Согласно настоящему изобретению несмотря на нулевую активность нитрилгидратазы в культурной среде, содержащей ион железа, в культуральной среде. содержащей ион кобальта, активность будет расти, Мож-но считать совершенно неожиданным, то, что деятельность нитрилгидратазы указанного специфичного микроорганизма будет решающим образом зависеть от типа присутствующего в культурной среде иона металла.Более того, в соответствии с настоящим; изобретением можно успешно проводить ратацию ароматического нитрила. П джительный эффект настоящего изобретения определяется важностью никотинамида - продукта гидратации З-цианопиридина, в качестве исходного продукта в синтезе витамина или пираэинамида - продукта гидратации цианопиразина, используемого в качестве туберкулостата.(м г/млл)" 1 1,06 Е/мг клето Е/мт соеды 1 Количество клет в пересчете на сухую масс единица активности согласно вышеприведенному опр ию, количество клето блица 2 Компонент твог сукна Кротонамид Ацетонитрил Г 1 ропионитрил Бензамид Пропионамид Ацетэмидщую 4,66 мг высушенных клеток, прибавляют к 4 мл реакционной смеси, содержащей 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8,0) и 3 М акрилонитрила, и 2 М акрилонитрила далее прибавляют через 0,5,1 и 2 часа после 5 начала реакции. Реакция при температуре 25"С приводит к получению через 8 часов после нэчэлэ реакции 9 М акрилонитрила, т.е. 640 г/литр, при конверсии 100 ф10 Формула изобретения1, Способ получения амидов, включающий гидратацию нитрилов при тепературе 10-30 С и рН 7 - 9, в присутствии нитрилгидрэтазы, полученной в процессе культивиро вэния микроорганизмов родэ ЯЬобососсоз - процентов нитрилгидратазы, с последуюгцим отделением целевого продукта, о т л ич э ю щ и й с я тем, что, с целью повышения производительности процесса, в качестве 20 микроорганизмов - продуцентов нитрилгидратазы используют штамм ВЬобососсиз йоОосЬгоов 1-1 (ГЕЯМ ВР), или АТСС 33278, или АТСС 33025,.а культивирование ведут в присутствии солей кобальта, которые 25 вводят в среду в количестве 5-15 мг/л в пересчете на хлорид двухвалентного кобальта.2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что гидрэтации подвергают алифатический нитрил - экрилонитрил. 30 3. Способ по и, 1, от л и ч а ю щ и й с я тем, что гидратации подвергают ароматический нитрил - бензонитрил, или о-, м- или п-хлорбензонитрил, или о-, м- или и-фторбензонитрил, или м-нитробензонитрил, или п-аминобензонитрил, или о-,м- или и-толунитрил, или 4-цианофенол, или анизонитрил, или фталонитрил, или изофталонитрил, или терефталонитрил, или 2,6-дихлорбензонитрил, или 2,4-дихлорбензонитрил, или 2,6-дифторбензонитрил, или а-, или /3-нафтонитрил,4, Способ по и. 1, о тл и ч а ю щи й с я тем, что гидратвции подвергают гетероциклические нитрилы,-3, или 4-цианопиридин, или 2-тиофенкарбонитрил, или 2-фуронитрил, или 5-цианоиндол, или цианопиразин.Приоритст по пунктам ф.и.18.09.87 - по пп. 1-4;26.03.88 - использование цианопиразинэ.Примечание.П,п, 1, 2, 3, 4 имеют приоритет от 18,09.87. Признак и, 3, касающийся сипользования для гидратэции фторбензонитрила, в котором Б и К 2 - атом фтора, имеет приоритет 16.09.88, Признак и. 4, касающийся использования цранопирЬзина имеет приоритет 26.03,88,1838416 22 Продолжение табл,2 едак Производственно-издательский комбинат "Патент ород, ул.Гагарина, 101 каз 2905 ВНИИПИ Составитель Г, ГолеваТехред М. Моргентал Корректор М. Максимишинец Тираж Подписноесударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушскэя наб., 4/51. Некоторые общие положения способа получения амида биологическим путемИзобретение относится к способу гидратации нитрила с превращением его в соответствующий амид действием нитрилгидратазы, образуемой микроорганизмом, и в основе способа лежит культивирование микроорганизма, индуцирование нитрилгидратазы и действие полученной в результате нитрилгидратазы на нитрил в качестве субстрата.Укаэанные стадии сами по себе известны в виде отдельных операций, и они в соответствующей форме используются в настоящем изобретении. Выражение "нитрилгидратазу получают культивированием микроорганизма в присутствии иона кобальта" имеет в виду индуцирование нитрилгидратазы как естественную предпосылку,Преамбула настоящего изобретения,звучащая как; "способ гидратации нитрила с его превращением в соответствующий амид действием нитрилгидратазы, образованной микроорганизмом". включает любые оформления или вариации, приводящие к действию нитрилгидратазы на нитрил. В качестве одного иэ примеров такого оформления можно указать способ выделения образованного микроорганизмом фермента и поеледующее его использование в виде ферментивного препарата, Такой путь использования нитрилгидратазы при котором фермент используют в виде ферментивного препарата, следует понимать, как попадающий в категорию "способа получения биологическим путем" настоящего изобретения.2, Подробности реакции гидратации1) МикроорганизмПрименяемый в настоящем изобретении микроорганизм относится к виду ЯЬодососсцз гподоспгооз.Представительным штаммом этого видаявляется штамм 1-1.Характеристика штамма И:(1) Происхождение и депоэитирование Штамм 1-1 выделен из почвы, отобранной в Сакио-ку, Киото, Япония, и депоэитирован как международный депозит (в соответствии с Будапештским Соглашением о международном признании депозитов микроорганизмов для целей патентной практики) в исследовательском Институте ферментации, ЯпонияАгентство по промышленным разработкам и технологии под регистрационным номером РЕЯМ ВР.(2) Наличие полиморфиэма в клетках - Клетки имеют форму5 длинных стержней наначальных этапах культивирования, рост сизменением формы изатем деление на ко 10 роткие бациллы.(5) Окраска по Граму - Положительная,(о) Состояния роста в различных культурных средах (30 С)20 (1) Бул ьоная культурана пластине агара - Окружность диаметром 1 мм (48 часов),неравномерная игладкая, поверхностьдовольно сухая, плос 25 кая, непрозрачная,бледно-оранжевая-розовая окраска,(2) Бульоная культурана скошенном агаре - Нити с довольно су 30 хой гладкой поверхностью, в сечениислегка проступающаядовольно сухая, бледно-оранжевая-розовая35 окраска.(3) Бульоная жидкаякультура - Цветущий рост, обраЬзование бактериальной клеточной мембраны, умеренное помутнение, образование осадка по мерероста.(4) Бульоная культурана столбике желатина - Рост мелкими час 45 тицами на поверхности, в форме конуса вчасти столбика, но нев его нижней части,разжижение желатина50 не наблюдается.(9) Усвоение неорганического источника азота:нитрат - Положител ьно.аммониевэя соль - Положительно,(25) Жирные кислоты ианализ клеточных стенок - Присутствие ненасыщенных и насыщенных жирных кислотнормального строения и туберкулостеариновой кислоты, ТТГмиколевой кислоты20дает одно пяВ результате классификации вышеприведенных бактериологических свойств всвете Вегдуз гпапцас от Яузтегпа 1 сВэстегооду), выясняется, что штэмл 1 -1 является аэробной, грэм-псгложитольнп,слабо кислотоустойчивой, каталэз-поло.к,тельной и негенерирующей зндоспор бзциллой, которая не внедряет жгутиков,эначальных стадиях роста имеет форму удлн 30 ненной палочки подобно мицепию,дс "1ветвлением и затем делится на короткиепалочки, Таким образом, признак г ее принадлежность к бактериям типа Косабэ.Анализ состава жирных кислот показывает, что бактерия содержит насыщенные иненасыщенные нормальные кислоты, в томчисле туберкулостеариновую кислоту, ТСХанализ миколевой кислоты дает одно пятнос тем же значением ВГ, что и для стандартной бактерии ВЬобососсоз ЬобосЬгоцз( Е 03338), что отличает ее от родаМусоЬастегипз. Она также отличается от рода Йосэгба составом (числом атомов углерода) миколевой кислоты, Из рассмотрения45 других биохимических свойств следует, чтобактерия является РЬобососсозгЬобосЬгооз,Кроме штамма -1, открытого создателями изобретения, и который по их мнениюявляется наиболее предпочтительным длявида В.г 1 обос 1 гоцз, нижеперечисленныештаммы являются примерами других штам. мов В.гЬобосЬгоцз, которые могут быть использованы в настоящем изобретении икоторые можно получить в указанных хранилищах:(Ч) ИСВ 11277Указанные штаммы депозитированы в огедующих хранилищахРО - Институт ферментации, Осака, Япония, газо НопгпасЫ 2 сЬогпе, Оза 1 а - зЫ, 532, Япония;3 М - Коллекция микроорганизмов Японии, Рикен (Институт физико-химических исследований). И/ао-зЫ, Яатата, 351-01, Япония;МСВ - Национальная коллекция промышленных и морских бактерий, Абердин, Шотландия, Великобритания.Микроорганизмы имеют тенденцию к мутациям. В связи с этим нет необходимости подчеркивать, что бактерия, даже являясь мутантом исходной бактерии, такой как штамм 1-1, может быть использована в способе настоящего изобретения, если только продукты культивирования мутанта образуют в присутствии ионов кобальта нитрилгидратазу,2) Субстрат (нитрил)Нитрилы, используемые в качестве субстрата нитрилгидратаэы, образованной вышеописанным микроорганизмом, относятся к ароматическим и алифатическим мононитрилам или динитрилом, особенно мононитрилам.Нитрилы, для которых наилучшим образом используются особенности настоящего изобретения, являются ароматическими нитрилами, в частности, нитрилы с 4-10 атомами углерода, образующими ароматический цикл. Несколько типичных примеров ароматических нитрилов представлены соединениями нижеследующих формул -(Ч)МТипичными для них являются 5-, 3- и2-цианопиридины;т (и)где Я и В соответственно представляют Н,1 2СНз, ОН, ОСНз, С, Р, СМ, КН 2 или й 02.К их числу относятся бензнитрил, о-, ми и-хлор или о-, м- и и-фтор- бензнитрилы, ои м-нитробензнитрилы, и-аминобензнитрил, о-, м- и п-толунитрилы, 4-цианофенол, анизонитрил, фталонитрил, иэофталонитрил, терефталонитрил, 2,6-дихлорбензнитрил и 2,4-дихлорбензнитрил, 2,6-дифторбензонитрил,(в 1 л среды) Типичным примером Ч является циано 20 пиразин.Другая группа нитрилов, составляющихобъект настоящего изобретения, включаетпредпочтительно алифатические нитрилы,более предпочтительно моно- или динитри 25 лы с 2-6 атомами углерода, но наиболеепредпочтительно-мононитрилы, С точкизрения полезности получаемых амидов типичным примером является акрилонитрил,образующийся с хорошими выходами,30 Ясно, без особого обсуждения, что амидами, соответствующими указанным нитрилам, являются амиды, полученныепревращением СМ-группы нитрилов вСОМН 2-группу, В случае динитрилов следу 35 ет рассматривать вариант получения соответствующих амидов превращением поменьшей мере одной СК-группы в СОМН 2- группу,3) Кул ьтиви рован ие-п родуци рова ние40 нитрилгидратазы,Культивирование микроорганизма видВросососсоз гЬобосЬгоцз может быть осуществлено в любых приемлемых условиях,но в присутствии в культурной среде ионов45 кобал ьта. Может оказаться общим п ра в илом введением в культурную среду индуктора фермента, подробно описанного ниже, сцелью вызвать накопление нитрилгидратазы в бактериальных клетках.50Баэальная среда,Примеры приемлемых культурных средиллюстрируются следующим образом. Дляспециалиста не составит труда изменениеколичеств-(а) компонента-(ов), приведенных55 ниже, замена одного компонента другим иисключение некоторых компонентов-(а) илидобавление других компонентов-(з),(11) Культурная среда Бглицерин 10 гПептон 5 гЭкстракт солода ЗгДрожжевой экстракт 3 гДистиллированнаявода Остальное (рН 7,2) (111) Культурная среда СДрожжевой экстракт 3 гКН 2 Р 04 0,5 г 30 К 2 Н Р 04 0,5 г1 Л 9 5047 Н 20 0,5 гДистиллированнаявода Остальное (рН 7,2) (2) Индукторфермента 35 Индукторами фермента, предназначенными для индуцирования и продукцирования нитрилгидратазы в микроорганизме ВЬобососсиэ йодосЬгоцэ могут служить любые пригодные для этой цели вещества. 40Типичными индукторами, пригодными для настоящего изобретения являются нитрилы и амиды.Примеры индукторов фермента, чье дейСтвие подтверждено для штамма 1-1, 45 включают следующие соединения; кротонамид, ацетонитрил, пропионитрил, бензамид, пропионамид, ацетамид, изовалеронитрил, н-бутиронитрил, изобутиронитрил, н-капронитрил, З-пентеннитрил, 50 пивалонитрил, н-бутирамид, изобутирамид, н-валерамид,н-капронамид,метакриамид и фенилацетамид.3) Источник ионов кобальтаНитрилгидратаза не образуется даже в 55 случае присутствия в культурной среде индуктора фермента, поэтому в соответствии с настоящим изобретением существенным моментом является присутствие в культурной среде ионов кобальта. Поскольку культурной средой являетсяводная среда, наличие ионов кобальта, какправило, создают добавлением в культурную среду водорастворимого соединениякобальта, Водорастворимые соединения кобальта приводятсл в химических справочниках. так что специалист без затрудненийвыберет и будет использовать приемлемоесоединение (в некоторых случалх с помощью простых предварительных опытов),Типичными соединениями кобальта являются соединения, дающие ионы Со и Со, вособенности, соединения, образующиеионы Со, и конкретные примеры соединеНгхй КОбаЛЬта ВКЛЮЧаЮт: ХЛОрИд КОбаЛЬта,сульфат кобальта, ацетат кобальта, бромидкобальта, борат кобальта и т.п,(4) КультивированиеКуль 1 ивирование с целью прод н:дния и, акопленил нитрилгидратазы в бактериальных клетках может быть осуществленокультивированием используемого микроорганизма, например. штамма 1-1 в культурных средах, описанных выше, в прием елнцхусловиях.Вигамин В 12 и металлический кобая гявляются другими примерами кобаль 1 овыхсоединений, т.к, они образуют гв эц ионкобальта в культуральной среде чер.:з .:,зационное и окислигельное действие мнкроорганизма в течение культивирования,Количество используемого индукторафермента составляет 2 - .6 г на литр культурной среды, количество. ионов кобальта составляет 5 - 15 г на литр культурной среды впересчете на СоС 12,Конкретные примеры состава культурных сред приводятся ниже,(11) Культурная среда С 1 литрКротонамид 2 гСо С 12 10 мгНитрилгидратаза может быть с успехомпродуцирована культивированием привстрлхивании штаммав температурноминтервале 15 - 50 С, предпочтительно 20 -45 С, наиболее предпочтительно около30 С при рН 7 - 9 в течение примерно 30часов или более, предпочтительно 40 часовили более (при верхнем пределе около 120часов). Индуктор фермента предпочтительно присутствует на начальном этапе культивирования и для получения бактериальныхклеток с высокой активностью желательнодобавление индуктора. Например. если10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 встряхивание культуры проводят при 28 С в течение 76 часов добавляют дополнительные количества кротонитрила спустя 26 и 56 часов после начала реакции с тем, чтобы его концентрация в каждый момент составляла 0,20, (мас,/об.).4) Гидратация нитрила - Преамбула йастоящего изобретения, звучащая как "способ получения амидов биалогическим путем, в котором нитрил гидратируют в соответствующий амид действием нитрилгидратазы, образованной микроорганизмом", включает, как указано выше,различные приемлемые оформления и вариации пути действия нитрилгидратазы на нитрил,Один из вариантов заключается в продуцировании амида в культурной среде микроорган изма, в которой в качествесубстрата присутствует нитрил. Другой вариант вызвать действие нитрил гидратазы на субстрат заключается в добавлении субстрата (нитрила) в культурную среду, в которой накоплена нитрилгидратаза. с проведением реакции гидратации, Видоизменением приведенного варианта является использование культурной среды, в которой клетки микроорганизма были разрушены с образованием "культурной среды, в которой накоплена нитрилгидратаза".Еще один вариант способа вызвать действие нитрилгидратазы на ее субстрат заключается в выделении клеток, в которых накоплена нитрилгидратаза, иэ культурной среды, предпочтительно путем нанесения клеток на приемлемый носитель или путем их "иммобилизации" с последующим их контактированием с субстратом, Этот способ, в частности, рекомендуемый вариантв котором применяют иммобилизованные клетки, как полагают, приемлем для промышленного использования и в этом отношении более предпочтителен по сравнению со вторыми вышеприведенными вариантами. Методика с применением иммобилизованных клеток хорошо известна, то же самое относится и к типу носителя, в целом же - это способ иммобилизации клеток на носителе и использование иммобилиэован ного микроорганизма в так называемом биореакторе.Другой вариант способа вызвать действие нитрилгидратазы на субстрат заключается в получении ферментивного препарата нитрилгидратазы и гидратировании нитрила с помощью ферментивного препарата, но не биологическим путем, Очевидно, что проведение реакции гидратации этим путем должно быть осуществлено при таких значениях рН и в таком температурном интервале, при которых активность фермента нетеряется. Можно сказать, что эти условиябудут теми же, что и в случае гидоатации"биологическим путем", приведенном выше, Как показано выше, вариант, в котороммикроорганизм отсутствует в ходе действияфермента, в настоящем изобретении такжерассматривается как "способ получения биологическим путем.Согласно настоящему изобретениюприемлемый интервал значений рН для нитрилгидратаэы составляет 7 - 9 при оптимальном значении рН 8. При значении рН врастворе ниже 7 активность фермента имеет тенденцию к резкому уменьшению. Соответственно, желательно добавление вреакционный раствор буфера, Даже при использовании одного из таких буферов каккалийфосфатный буфер, буфер трис-НС, буфер НЕРЕЯ-КОН и натрийборатный буферферметивная активность нитрилгидратаэыне меняется,Концентрация субстрата в культурнойсреде или в растврре, реакции гидратации,как правило, составляет интервал 4 - 7 молей на литр, температурный интервал реакции обычно 10 - 30 С.3, Экспериментальные образцы.Способ измерения ак.гивности нитрилгидратазы и определение единицы активности в экспериментальных образцахприводятся ниже,(1) Способ определения активности нитрилгидратаэы.Активность нитрилгидратаэы измеряютпроведением реакции с 2 мл реакционнойсмеси, содеркащей 10 мМ бензнитрила, 30мМ калийфосфатного буфера (рН 7) и определенное количество клеток микроорганизма (выделенных из культурной среды) 5минут при 10 С и добавлением 2 мл 1 н. НСдля прекращения реакции,(2) Определение для единицы активностиОдну единицу(Е) активности нитрилгидратаэы определяют как количество фермента, необходимое для образованиябенэамида иэ бензнитрила в вышеприведенных условиях со скоростью 1мкмоль/мин.Ссылочный пример 1.Штамм 1-1 культивируют в культурнойсреде, состав которой приведен нике, в условиях, которые также приводятся нлже, ипроявления активности нитрилгидратазывыявляютдобавлением СоС 2 и/или ЕеЯО ккультурной среде в ходе культивирования.(1) Состав культурной средыКомпонент Количество3 мл 0,5 г 0,5 г 0,5 г 2 мл Витаминная смесьКгНРОлКНгРОлМ 9 ЯОл 7 НгОПропионитрилДистиллированнаявода Остальное (рН 7,2) (И) Условия культивирования28 ОС, 70-80 чПолученные результаты приводятся в табл, 1.Можно видеть, что активность нитрилгидратазы не проявляется даже при добавлении ЕеЗОл к базовой среде, но проявпяется при добавлении СоСг, причем добавление ГеЯО 4 в систему, в которую уже добавляя СоСг, неблагоприятным образом влияет на результаты,Ссылочный пример 2.Действие различных нитрилов или амидов в качестве индукторов штаммапоказано в нижеприведенной Таблице,Приведенные в табл. 2 результаты получены предварительным культивированием штамма 1-1 в вышеописанной культурной среде В при 28 ОС при добавлении нитрила или амида в качестве индуктора в количестве 0,1% (об./об.) или 0,2% (мас./об,) соответственно после достаточной пролиферации штамма с последующим заражением штаммом вышеприведенной культурной среды С, в которую добавлено 0,001% (мас,/об,) СоСг, и культивированием 36-48 часов,П р и м е р 1, Клетки штамма, полученные культивированием штамма в культурной среде, состоящей из вышеописанной культурной среды С, в которую добавлены СОСг и кротондмид В количествах соответственно 0,01 г и 2 г на литр среды, вводят в реакцию с различными, используемыми в качестве субстратов нитрилами, Реакцию проводят исйользованием 2 мл реакционного раствора, содержащего клетки, полученные из 2 мл культуры, 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 200 мМ субстрата (25 С, 76 часов), Реакцию прекращают добавлением 0,2 лл 1 н. НС, Активность нитрилгидратаэы по отношению к соответствующим субстратам определяют как отношение израсходованного количества субстрата или продукта реакции, определенное с помощью ЖХВД, к активности нитрилгидратазы, определенной при использовании в качестве субстрата 3-цианопиридина, и называют удельной активностью (%).Полученные результаты приводятсл нике.Субстрат Уд. активность ф) 3-Цианопиридин 100Акрилонитрил 1064-Цианопиридин 1292-Цианопиридин 645-Цианоиндол 92-Тиофенонитрил 1162-Фуронитрил 71Бензонитрил 804-Цианофенол 2410 и-Лминобензнитрил 16м-Нитробензнитрил 7о-Нитробензнитрил 16м-Хлорбенэнитрил 29и-Толунитрил 515 м-Толунитрил 46Анизонитрил 20о-Хлорбензонитрил 41и-Хлорбенэнитрил 72,4-Дихлорбензнитрил 220 2,6-ДихлорбензнитрилЦианопиразин 80П р и м е р 2. В колбу Сакагучи на 1 литрпомещают 400 мл культурной среды, состоящую из вышеописанной культурной среды 25 С, в которуюдобавлены СоСг и кротонамидв количестве соответственно 0,01 и 2 г на литр среды, и смесь культивируют при 28 С на трясучке. Культивирование продолкают с добавлением в культурную среду 0,2;ь 30 (масс./об,) кротонамида (800 мг/400 мл) через 30 и 60 часов после начала культивирования.Бактериальные клетки отделяют центрифугированием культурной среды (1200 ц, 35 15 минут) в центрифужном сепэраторе (Хитачи, модель ЯСК 20 В); промывают 0,85;ьМаС, вновь центрифугируют и суспендируют в 40 мл вышеописанного раствора, Отбирают в качестве образца небольшое 40 количество суспензии и используют для,подсчета сухой массы бактериальных клеток в суспенэии.Содеркащую клетки суспензию (соответствует 2,33 мг сухих клеток) добавляют к 45 4 мл реакционного раствора, содержащего10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 3-цианопиридина (4,57 М) и реакционную смесь выдерживают в течение ночи при 25 С, добавляя к реакционному раствору 50 0,55 М и 0,49 М 3-цианопиридина серу 3 и 6часов соответственно, Через 18 часов посла реакции инициирования выход никотинамида 5,58 М, Соответственно, конверсия составляет 99,5 ф, что соответствует 55 накоплению никотинамида в количестве 681г. При данной концентрации продукт реакции затвердевает в результате отложения никотинамид.Полученный в результате никотинамидидентифицируют выделением продукта воиде кристаллов, проведением элементногоанализа, ИК-, ЯМР- и масс-спектрометрии,Никотинооая кислота не обнаружена.П р и м е р 3, Содержащую клетки суспензию (соответствует 2,33 мг сухих клеток, 5полученных о примере 2) добавляют к 4 млреакционного раствора, содержащего 10мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и цианопиразин о различной концентрации, В результате 6-ти часовой реакции четыре моля 10цианопиразина превращены со 100%-ойконверсией о пиразинамид, шесть молейцианопираэина превращены в результате 9 ти часовой реакции, С другой стороны, придобавлении суспензии, содержащей 4,66 15мг сухой массы, а не 2,33 мг, как оописанном выше опыте, к аналогичномуреакционному раствору (4 мл)7 М цианопиразина превращаот в пиразинамид с конверсией 100% в результате 6-ти 20часовой реакции, 8 М цианопиразина превращают о результате 9-ти-часовой реакции, Образование пиразинкарбоновойкислоты не обнаружено.Пиразинамид кристаллизуется из растоора по мере образования. Кристаллический осадок отделяют иперекристаллиэовывают из метанола. Принадлежность кристаллов пиразинамидуподтверждено элементньм анализом, ИК-. 30ЛЛР- и масс-спектрометрией,Анализ цианопираэина, пиразинамидаи пиразинкарбоновой кислоты проведен сг:омощью высокоэффективной жидкостнойхроматографии, 35Аналогичный анализ также проводилсяо нижеследующих примерах.П р и м е р 4, Суспенэию боктериальныхклеток (соответствует 4,66 мг сухих клеток),полученную о примере 2, добавляют к 4 млреакционного раствора, содержащего 10мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 3 Мметакрилонитрила соответственно через 1 и3 часа после начала реакции. Спустя 12 часов после начала реакции образуется 9 М 45мотакриламида с конверсией 100%,В вышеописанной реакции при прибавлении дополнительно 1 М метакрилонитрила через 5 часов после начала реакцииг олучают 10 М метакриламида (конверсия100%) через 24 часа после начала реакции,Концентрация о 10 М соответствует 851 гметакриламида, которые образуются и накапливаются в пересчете на 1 литр реакци 55онного раствора,Реакционный раствор разбавляют водой и бактериальные клетки удаляют центрифугирооанием (12000 9, 15 минут),Свободный, от клеток раствор концентрируют в роторном испарителе и коисталлизуют,Затем кристаллы растворяют и перекристаллизовыоают из воды с получением кристаллического метакриламида,П р и м е р 5. Суспензию бактериальных клеток (соответствует 4,66 мг сухих клеток), приготовленную в примере 3, добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 1 М кротонитрила, после чего при 25 С проводят оеакции с пятикратным добавлением о реакционный раствор с интервалом в 1 час метакрилонитрила порциями в 1 М, Через 6 часов после начала реакции получают 6 М кротонамида (коноерсия 100%), При добавлении к реакционному раствору через 6 и 10 часов порциями из реакции инициирования по 1 М кротонитрила получают соотоетственно 7 М и 8 М кротонамида (конверсия 100% после 10 и 22 часов соответственно). Концентрация 8 М соответствует 681 г образованного и накопленного кротонамида в пересчете на 1 литр реакционного раствора.Кристаллизацию кротонамида проводят так, как указано в примере 4,П р и м е р 6. Суспензию бактериальных клеток(соответствует 4,66 мг сухих клеток), приготовленную в примере 3, добавляют к 4 мл реакционного раствора. содсржащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 3 М ацетонитрила, после чего при 25 С проводят реакцию с добавлением через 1 час и 3 часа после начала реакции инициирования 3 М ацетонитрила и через 6 часов еще 5 М ацетонитрила. Через 12 часов после начала реакции получают 12 М ацетамида (конверсия 100%), Другими словами в пересчете на 1 литр реакционного раствора образуется и накапливается 827 г ацетамида.Реакционный раствор разбавляют водой и для удаления бактериальных клеток подвергают центрифугирооанию. Полученный раствор концентрируют досуха в роторном испарителе, растворяют в метаноле и после кристаллизации иэ метанола получают кристаллический ацетамид.П р и м е р 7, Суспенэию бактериальных клеток (соответствует 4,66 мг сухих клеток), приготовленную в примере 2. добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 3 М З-гидроксипропионитрила, после чего проводят реакцию при 25 С с добавлением в реакционный раствор порциями о ЗМ 3-гидроксипропионитрила о общей сложности 4 раза с интервалом в 1 час после начала реакции. Через 5 часов после начала реакции получают 15 М 3-гидроксипропионамида (конверсия 100%), При добавлении на этом этапе дополнительно 3 М 3-гидроксипропи 18384165 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 онитрила в реакционном растворе получают 18 М 3-гидроксипропионамида (конверсия 1 ЦОО спустя 11 часов реакции инициирования). В пересчете на 1 литр реакционного раствора это соответствует 1600 г образованного и накопленного 3-гидроксипропионамида.Реакционный раствор разбавляют водой и для удаления бактериальных клеток подвергают центрифугированию. Свободный от клеток раствор концентрируют в роторном испарителе и кристаллиэуют при 20 С. Кристаллы растворяют в изопропаноле и после кристаллизации иэ того же растворителе получают кристаллический З-гидроксипропионамид,П р и м е р 8. В колбу Сакагучи на 1 литр помещают 400 мл культурной среды, состоящую из вышеописанной культурной среды С, в которую добавлены СоС 2 и кротонамид в количестве соответственно 0,01 и 2 г на литр среды, и смесь культивируют при 28 С на трясучке. Культивирование продолжают с добавлением в культурную среду 0,2(масс./об.) кротонамида (800 мг/400 мл) через 26 и 56 часов после начала культивирования и останавливают через 76 часов,Бактериальные клетки отделяют центрифугированием культурной среды (1000 ц.20 минут) в цетрифужном сепараторе (Хитачи, модель ЯСЯ 20 В), промывают 0,85% МаС), вновь центрифугируют и суспензируют в 40 мл вышеописанного раствора. Отбирают в качестве образца небольшое количество суспензии и используют для подсчета сухой массы бактериальных клеток в суспензии.Содержащую клетки суспензию (соответствует 2,96 мг сухих клеток) добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 3-цианспирадин в различной концентрации. В результате 9-ти часовой реакции восемь моли цианопиридина превращены со 100 О- ой конверсией в никотинамид, девять молей 3-цианопиридина превращены в результате 22-ух часовой реакции, С другой стороны, при дсбавлении суспензии, содержащей 5,98 мг сухой массы, а не 2,96 мг, как описанном выше опыте, к аналогичному реакционному раствору (4 мл) 9 МЗ- цианопиридина превращают в никотинамид с конверсией 100 О в результате 5-ти часовой реакции, 12 Мцианопиридина превращают в результате 9-ти часовой реакции. Образование кислоты не обнаружено.Никотинамид кристаллизуется из раствора по мере образования, Кристаллы отделяют и перекристаллизовыаают из метанола. П р и м е р 9. Суспензию бактериальных клеток (соответствует 5,92 мг сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют к 4 мл реакционного раствора. содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8) и 1 М безнитрила и реакцию осуществляют при 25 С, добавляя 1 М бензнитрила соответственно через 1, 2, 3, 4, 5 и 7 часа после начала реакции образуется 7 М бензамида с конверсией 100 6 (848 гр/литр).П р и м е р 10, Суспенэию бактериальных клеток (соответствует 5,92 мг сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют 4 мл реакционного раствора содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (оН 8,0) и 1 М 2,б-дифторбензнитрила, и реакцию осуществляют при 25 С добавляя 1 М 2,б-дифторбензнитрила к реакционному раствору после 2, 4, б и 8 часов начала реакции инициирования соответственно.Спустя 22 часа после реакции инициирования получают 2,5 М (393 гр/лит) 2,6- дифторбензамида со 100;ь конверсией.П р и м е р 11. Суспензию бактериальных клеток (соответствующую 5,92 мг сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8,0) и 1 М 2-тиофенкарбонитрила, и реакцию осуществляют при 25 С, добавляя 1 М 2-тиофенкарбонитрила в реакционный раствор спустя 1 час после началареакции инициирования. Спустя 5 часов после ее начала получают 2 М (254 г/л) 2-тиофен карбоксамида СО 100 оь конверсией.П р и и е р 12. Суспенэию бактериальных клеток (содержащую 5,92 мг сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8,0) и 1 М 2-фуронитрила и реакцию осуществляют при 25 С, добавляя 1 М 2-фуронитрила к реакционному раствору спустя 1, 2, 4, б, 8, 11 и 23 часа после начала реакции инициирования соответственно. Спустя 30 часов после начала реакции получают 8 М (888 г/литр) 2-фуранкарбоксамида со 1000/о конверсией.П р и м е р 13. Суспензию бактериальных клеток (содержащую 5,92 мг, сухих клеток), полученную в примере 8, добавляют к 4 мл реакционного раствора, содержащего 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 8,0) и 4 М 3-индолацетонитрила и реакцию осуществляют при 25 С,Спустя 24 цаса после начала реакции инициирования получают 4 М (697 г/л) 3-индолацетамида со 100 конверсией,П р и и е р 14, Клеточную дисперсию,полученную в примере 2 и соответствую