Способ определения фагоцитарной активности клеток крови

. РЕСПУБЛИК 09) (11) 9 а) 6 01 И 33/48ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР.2. ЗйепВеп Ю.фМ 1 сгоощап 1 ев 1 аЬе 11 ай с 14 аког Меавцгещепй оЕ РЬас)о-, з 3.Мв 1 вфф, АгсЬ, 1 ввцпо 1, ВЬег. ехр.1980, 28, 94-104 (прототип).(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИ ТАРНОИ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК КРОВИ путем инкубирования суспенэни лейкоцитов с фагоцитируемым агентом, о т л и ч ею щ и й с я тем, что с целью одновременного измерения связывания и поглощения растворимых белков, в качестве фгоцитируемого агента используют:-", 1-гамма-глобулин, агрегиро" ванный прогреванием при 60-63 и рН 7,2"7,3, затем полученный агрегат инкубируют с суспенэией клеток в течение 2-3 ч при 36-37, после чего его делят на две пробы, одну из которых отмывают Физиологическим раствором и определяют радиометрически суммар" ное количество присоединенного белка, другую - обрабатывают 0,2"0,3- ным раствором трипсина и определяют количество поглощенного белка, по от-Е ношению поглощенного и присоединен" ного белка определяют фагоцитарнуа активность клеток.Изобретение относится к медицине и может быть использовано в иммунологииИзвестен метод исследования фагоцитарной активности клеток путем инкубации лейкОцитов крови человека с культурой стафилококков с,последующим визуальным подсчетом в микроскоп количества поглощенных лейкоцитами микроорганизмов (1.Известен также способ определения 10 фагоцитарной активности клеток крови путем инкубиронания суспензии лейкоцитов с фагоцитируемым агентом, представляющий собоймикроорганизмы, меченные фС Г 23 . 15Недостатком известных способов .яв ляется невозможность использования их для определения фагоцитоза раствори. мых белковых агрегатов.Цель изобретения - одновременное измерение связывания и поглоцения клетками крови растворимых белков.Указанная цель достигается твм, что согласно способу определения фагоцитарной активности клеток крови путем инкубировання суспензии лейкоцитов с фагоцитируемым агентом н качестве фагоцитируемого агента используют ("1-гамма-глобулин, агрегированный прогреванием при 60-63 и рН 7,2-7,3, затем полученный агрегат инкубируют с суспенэией клеток в течение 2-3 ч при 36-37 С, после чего вго делят на две пробы, одну из которых отмывают физиологическим раствором и определяют радиометрически сум"35 марнов количество присоединенного белка, другую " обрабатывают 0,2-0,3- ным раствором трипсина и определяют количество поглощенного белкапо отношению поглощенного и присоединен" 0ного белка определяют фагоцитарнуюактивность клеток. Способ осуществляют следующим образом.45Фракцию 11 Кона (гамма"глобулин)растворяют в .0,1 М фосфатном буфере рН 7,2-7,3 иэ расчета 5 мг/мл и агр гируют прогренанием на водяной банеопри 60 в течение 40 мин. После этого раствор центрифугируют 30 мин при 7000 об/мин. Используют надосадочную , Фракцию, н которой концентрацию белка определяют по Лоури. Агрегированный гамма"глобулин мв= тят изотопом 4 ф 1 с помощью лактоперок сидазного метода.Для этого 25 мкг бел ка при концентрации 1 мг/мл разводят в 30 мкл 0,3 М фосфатного буфера рН 7,после чего добавляют 1 мкл раствора лактопероксидаэы (1 мг фермента, 1 мл ЗИ фосфатного буфера, .1 мл глицерина), 450 мкКи ф 1 и 10 мкл 0,88 мИ раствора перекиси водорода. После инкубации в течение 10 мин при 20 вновь добавляют 10 мкл 0,88 мМораствора перекиси водорода, инкубируют 5 мин при 20"и останавливают реакцию добавлением 0,5 мл 10 мМ раствора дитиотриэтолаЧерез. 10 мин несвязанный изотоп "1 отделяют от связанного с белком фильтрацией на сефадексе Г. Меченный белок разно. дят немеченным агрегированным гамма" глобулином из расчета 50000 имп/мин на 5 мкг белка н 20 мл фосфатного бу. фера.Кровь от донора в количестве 10 мл берут из локтевой нены в пробирку с гепарином (25 ед. гепарина на 1 мл крови). После отстаинания эритроцитон плазму с лейкоцитарной массой центрифугируют при 1500 об/мин Б мин, Оставшиеся н осадке эритроциты лизируют 0,86-ным раствором хлористого аммония, а лейкоциты трижды отмывают раствором Хенкса и доводят до концентрации 410клеток/мл среды Р 199.К 0,5 мл суспензии лейкоцитов (2 10 клеток) добавляют 5 мкг/20 мкл агрегированного белка (50000 .имп/мин) и инкубируют в термостате при 37 фн течение 2-3 ч с периодическим встряхиванием через каждые 15 мин. Всего приготавливают 6 проб с 2.10 клеток, После инкубации три пробы отмывают трижды изотоническим раствором хлористого натрия, а три другие после двукратной отмывки изотоничвским раствором обрабатывают 0,25-ным . раствором трипсина, Радиоактивность клеток после удаления недостаточной жидкости подсчитывают в гамма-сцинтилляционном счетчике и рассчитывают средние показатели для трех параллельных образцов.Э таблице приведены данные, иллюстрируюцие фагоцитарную активностьлейкоцитов у здоровых доноров и больных миокардитом.1037177 Суммарное количест Количество поглово присоединенного щенного белка,белка Доноры имп/мин Ъ не вне- имп/мин % от внесенного сенного Ъ бт внесенного 0,74 16, 3 4,2 6056+44 12 1 21,5 65 7498+56 15,0 070 Больные1 865037 76 ОИ 41 15,2 9805143 19,6 8703+36 17,4 0,88 2,1 17,3 3,3 2 11450+46 22,9 086 0,90 39652140 19,3 Предложенный способ определения фагоцитарной активности клеток крови дает возможность определить способность клеток связывать и поглощать растворимые белковые вещества, .что необходимо для изучения процес-. са элиминации из организма,иммунныхкомплексов. Способ позволяет уточнить характер дефекта фагоцитарнойФункции клеток, что важно для выяснения цатогенеза многих заболева 1 Уф,Составитель В.Ю.АрцатбановРедактор В.Лазаренко Техред М.Тепер Корректор И. Ватрушкина Заказ 6001/46 Тираж 873ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж-ЗЬ, Раузюкая наб., д. 4/5 Подписное филиал ППП Патентфе, г.ужгород,ул.Проектная, 4 Здоровые 18166+50 210754144 Количест"во связанного бел"ка,агоциарнаяк тивость