Способ получения полисахаридов ксантанового типа

/06 5)5 С 12 Р 1 г,РЕТЕНИЯ ПИСААТЕНТУ Е итэ Шимик (Гй)ишель Пейнье Пи Ив Кеннель(Е4, кл, С 12 Р 19/ 6,ржать арозу, т дости- проду т напри и вида ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(56) Патент ЕПВ Ы 58361982. Изобретеьие относится к получению биополимеров, используемых в качестве сгущающих агентов при эксплуатации нефтяных месторождений, в частности, отноСится к способу получения полисахаридов ксантанового типа.Цель изобретения заключается в устранении указанных недостатков и увеличении выхода полимера. Эта цель достигается способом культивирования микроорганизмов в водной питательной среде, содержащей углеводы, источник азота и факторы роста, в условиях аэрации и перемешивания культу- ральной среды, заключающимся в том, что используют эмульсию типа масло-в-воде, содержащую 1-30 масла,Водная фаза среды может содкачестве углеводов глюкозу или саинтервале от 10 до 100 г/л, но можгать 150-200 г/л,В качестве микроорганизмовцентов полисахаридов используюмер, природные бактериХапйоеопаз сагпрез 1 гз,ггсг .Й 2 гггг 1 83841 7 АЗ(51) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения полисахариров ксантанового типа, Природные бактерии вида Хапт 1)огпопаз Сагпрезтг 1 з продуценты полисахаридов культивируют на питательной среде, содержащей углеводы, источник азота и факторы роста. Процесс ведут в эмульсии типа "масло-в-воде", содержащей 1-307. масла. Эмульсию стабилизируют добавлением ПАВ с Н 1 В 6 11. 2 з,п. ф-лы, 2 табл В качестве масла можно использовать любое минеральное или растительное масло, не смешивающееся с водой, например, изопаргфины, деодорированный керосин, углеводороды с высокой температурой кипения, предпочтительно выше 150-200 С; рапсовое, соевое, кукурузное, подсолнечное, арахисовое и другие масла, Желательно, чтобы доля масляной фазы составляла менее 30 среди, предпочтительно 1-18 и еще более предпочтительно 3-161 ь. Диспергированию и стабилизации масляной фазы в водной фазе благоприятствуют пвверхностно-активные вещества, предпочтительно неионные, величина Н В которых предпочтительно ниже 11 и более предпочтительно составляет 6-11, причем эта величина может быть получена с помощью одного поверхностно-активного вещества или смеси поверхностно-активных веществ, Выбор и количество поверхностно-активного вещества, необходимого для получения непрерывной водной фазы, легко определяется специалистом в зависимостиот выбранного масла и его концентрации в среде,В качестве цеиоццого поверхностно-активного вещества гложцо использовать соединения, получаемые путем конденсации эпкилеиоксида с алифатическим или элкиларомдтическим органическигл соединением. Соответствующими поверхностно-активными веществами, которые це игггибиругот рост микроорганизмов, являются иолиоксиэтилецирооанцые ал- к и л ф е и о л ы, и олиоксиэтилинирооаццые спирты, полиоксиэтилинирооанн ые жирные кислоты. полиоксиэтилинирооанные триглицериды, попиоксиэтилинирооанные сложные эфиры сорбитаца и жирных кислот.Поверхностно-активные вещества можно вводить полностью или частично, о зависимости от их сродства, в масляную. или оодггуго фазу.Для осуществления способа глокцо стерилизовать отдельно гласляную фазу и водную фазу, После стериализации и охлаждения масляная фаза может быть смешана с содержащейся о ферментере водной фазой или каждая из фаз может быть введена непрерывно о фермецтер при перемешиоании. Негледленгго образуется стабильная эмульсия. Посев и ферментация затем проводят известным способом при аэрации и иеремешивании. В процессе ферментации рН-зцачение может поддерживаться при сптимдльцом значении за счет впрыскивация щелочного или аммиачного раствора. Также можно осуществлять периодически или непрерывно воедение необходимой для роста среды.В конце ферментэции и в зависимости от области применения, эмульсию можно использовать такой, какая есть, илгл водцую фазу можноотделить от масляной фазы зд счет дестабилизации эмульсии известным образом, а сусло можно испольэовать в неочищенном виде, или можно осадить из него пописахдрид добавлением низшего спирта, например, изопропанола, с добаолениегл ири необходимости, Осажденный полисахарид отделяют, вымывают адсорбирооавшееся на волокнах масло, затем высушивают и о известных случаях размельчают. Таким образом получают готовый для использования порошок. Согласно другому варианту способа, полученную после ферментации эмульсию концентрируют путем удаления воды до получения эмульсии. содержащей 8-60 и предпочтительно 15-60 вес. полисахарида в расчете на вес эмульсии. В этом случае количество используемого для осуществления ферментдции масла должно быть рассчитано в зависимости от содержания сухого вещества в конце фермецтации.Предпочтительно, количество масла в ко 5 цечцой эмульсии не должно превышать 450всей среды.Воду удаляют, например, выпариванием или отгоцкой, о известных случаях, ирипарциональцом давлении. Часть масляной"0 фазы гложет удаляться в виде азеотроинойсмеси с оодой. ЬЛажгго ггрооодить ультрафильтрацию, используя известные методы и оборудование, ири условии выбора пористойгидрофильцой мембраны, поры которой до 15 статочцо малы для предупреждения происхождения биоиолимера через мембрану.Ультрдфильтрдция обеспечивает сохра-.нение эмульсий в непрерывной водной фазе. Концентрация за счет ультрафильтрации20 имеет еще то преимущество, что сохраняетсодержание георгднических солей в воднойфазе при значениях, близких к таковым,имеющимся о начальном сусле, каково быци было содержание полимера.В оиде оариагта,. можно ко 1 щентрировать эмульсиго сначала путем ультрафильтрации, и затем с помощью другой операции,например, выпариванием или дистилляцией.80 К полученным эмульсиям можно добавлять ири необходимости бактерициды, фермецты или любую другую добавку,ггредназггдчеггггую для особого использования, при условии, что эта добавка не вредитЗ 5 стабильности эмульсии.Эмульсии масло-о-воде, согласно иэо, бретеггиго, могут применяться оо осех областях, где требуются вязкообразные водныесреды, например, в строительстве при изго 40 товлении красок, в косметической промышленности, фитосанитарии, нефтянойпромышленности и т.д, Они обладают темпреимуществом, что их можно использоватьнеиосредстоеццо для приготовления водных"5 разбавленных растворов беэ необходимостипрохождения фазы инверсии, Они очень хорошо дисиерируются в воде, скорость ихрастворения ио крайней мере равна таковойисходного сусла. Они хорошо прокачивают 50 ся и стабильны в очень широкогл концентрационном интервале. гЛх вязкостьсущественно ниже таковой водного раствора, содержащего эквивалентное количествобиоиолимера, так, что гложно иметь прокачи 55 ваемые или текучие эмульсии с повышенными концентрациями полисахаридов вводной Фазе,Следующие примеры дэны в качествеиллюстративных и не ограничивают обьемаизобретения.Во всех этих примерах поступают следующим образом:питательный водный раствор загружают в Ферментер и стериализуют;масло, содержащее, если этом имеет место, поверхностно-активное (поверхностно-активные) вещества (а) стериализуют и выливают при перемешивании в водный; содержащийся в ферментере водный раствор при комнатной температуре;среду засевают предкультурой Хрпйовопаз саарезгз на питательном бульоне МУ, с концентрацией сахарозы 10 г/л,П р и м е р 1. В ферментер емкостью 20 л помещают 210 г предкультуры, 14 л стери- альной эМульсии масло в воде, содержащей по объему 6,25% масляной Фазы и 93,75% водной Фазы.Состав водной Фазы, г/л:декстроза 61дрожжевой экстракт 7Маг- Р 04 2,35(Ехзо Д 100, выпускаемый фирмой ЕззоС 1 еп 1 е этоксилированные нонилфенолы . 30 мас. %(смесь 67/33 СепаlзоИР 4 и Сегпозо МР 17продажные маркиФирмы ЯДОЯ;показатель Н В: 11Условия ферментациитемпература 28 ОСрН. регулируемое при 7, добавлением раствора гидроксида натрияперемешивание 400 об/минаэрация 0-17 ч 0,24 об. скорость в мин.17-23 ч 0,48-"- 23-90 ч 0,98 -"- Ферментацию осуществляют до полного исчезновения сахара.продолжительность: 90 чЭволюция популяции и удельное сопротивление среды с течением времени указаны в табл.1.Количество полученного действующего начала составляет 425 г (30,3 г/кг), или выход по отношению к сахару составляет 56%.Вязкость эмульсии в конце ферментации составляет 8,1 Па с (вязкость по Брукфильду при 20 С - игла М 4-30 т (мин).П р и и е р 2. Повторяют пример 1 с начальной средой, состоящей на 29% по обь ему из углеводорода Ехзо 0100 и 71% водной фазы, имеющей следующий состав,.г/л: 30 декстроза. 645 дрожжевой экстракт 9,24;йагНРО 4 3,08(ЙН)зРО 4 3,08 .М 93047 Н 20 0,35Поверхностно-активный агент не добав 10 ляется,Рабочие условия идентичны таковымпримера 1, за исключением аэрации, которая постоянно составляет 0,98 об.скоростьв мин, Ферментация длится 85 ч до стадии,15 при которой нет больше никакого сахара.Эволюция популяции и удельное сопротивление среды даны в табл,1. Получают ЗЗОг действующего начала, или выход составляет 51,3% по отношению к сахару, Вязкость20 конечной эмульсии составляет 10,2 Па с (тежЕ условия, что и в примере 1),П р и м е р 3. Начальная эмульсия маслов воде получается из 14,125 л водной фазыи 0,875 л масляной фазы.25 Состав водной Фазы, г/л:сахароза. . 85растворимыйкукурузный экст-.ракт (С ЯЕ) 25,5М 9304 7 Н 200,28Масляная фаза содержит 70 вес.% рапсового масла и 30% этоксилированного нонилфенола (Сегпцзо ИР 4).Показатель Н.В: 935 Среду засевают как в примере 1.Условия ферментации:температура 28 СрН, регулируемое при 7, путем добавления раствора гидроксида натрия40 перемешивание 0-17 ч 390 об/мин17-24 ч 500 об/мин24-84 ч 600 аб/минаэрация 0-17 ч 0.92 об. скорость в мин,45 17-84 ч 1,4 -"- средняя сила рассеяния (; 6,09 Кй/)м,По истечении 84 ч получают 51 г ксантановой смолы на кг среды. Выход в расчетена израсходованную сахарозу: 64%,50 Консистенция К (по закону Освальда)среды составляет 37 Па с и показатель псевдопластичности "и"=0,195.По сравнению с этим. водное сусло, содержащее 48,5 г/кг полимера, имеет конси 55 стенцию К=70 Па с и показатель "и"=0,24,Продолжают Ферментацию до 113 часов. Получают 66 г/кг полимера. Выход врасчете на израсходованную сахарозу 83%.1838417 80 ч Таблица 1Изменение популяции и удельного сопротивления среды во времеи Л римеры 4 и 5, Реализуютдве ферментации в эмульсии масло в воде. содержащей 0,875 л масляной фазы и 14,125 л водной фазы,Состав среды следующий, %:сахароза 8 растворимый кукурузный экстракт (СЯ 1 )МЦЯ 047 Н 20 0,05 .масло 3 5 поверхностно-активные вещества 1,5 Масляная фаза образована рапсовым маслом и нативными жирными этоксилированными спиртами (Сепщзо АБВЦдля примера 4, алифатическими углеводородами (Ехзо 080) и зтоксилированньгми нонилфенолами (смесь 50/БО Севозо ЙР 4 " СевЫзо ЙР 17 для примера 5).Условия ферментэции следующие: Темпера- Аэрация Переметура: 28 Сшивание0-17 ч 0,92 390 об/ми после 17 ч 1,39 500 об/мин после 41 ч 1,39 500 об/мин, Ферментация продолжается вплоть до полного исчезновения сэхарозы:Результаты Пример 4 Пример 5 продолжи тельность 68 чдействующееначало 47,4 г/кг 51 г/кг выход в расчете насэхэрозу 60% 64% П р и м е р ы 6-14. С помощью 1 млпредкультуры ХапФогпопаз сэпрез 1 гз нэпитательном бульоне МУ с 10 г/л сахарозызасевают 100 мл эмульсионной среды масло. 5 . в воде, содержащейся в колбе Эрленмейераемкостью 500 мл,Водная фаза, общая для всех примеров,идентична таковой прилере 3..Изменяют состав масляной фазы. Каж 10 дэя колба содержит 95 мас,% водной фазыи 5 мас.% масляной фазы. Содержилье колбперемешивают с помощью ротационно ой мешалки, вращающейся со скоростью 220об/мин с амплитудой 5 см и инкубируют при15 28 С в течение 89 ч. Результаты указаны втабл.2.Формула изобретения1. Способ получения полисэхаридовксантанового типа, включающий культиви 20 рование микроорганизмов-продуцентовполисахаридов нэ питательной среде, содержащей углеводы, источник азота и факторы роста, о условиях аэрации иперемешивание культуральной жидкости,25 причесал культивирование осуществляют омаслосодержащей эмульсии, о т л и ч а ю щ и.й с я телл что, с целью повышения вь 1 ходацелевого продукта, используют эмульсию типа масло в воде, содержащую 1-30% лэслэ.30 2. Способ по и. 1, о т л и ч э ю щ и й с ятем, что в качестве микроорганизмов-продуцентов полисэхаридов используют природные бактерии. вида Хапйовопэз сэтрез 1 гз.3, Способ поп.1 или 2,отл ичающи 35 й с я тем, что, с целью стабилизации элульсии, Ь нее вводятповерхностно-активноевещество с Н В 6-11.10 1838417 Таблица 2 Количество получаеного полинера и выход Ферментации в зависиности от композиции масляной Фазы67 а Э 1 О . 11 12 13 14 Пример е Природа и Репсозоесостав масламСоевоеВхво 1 080 35 3,5 3,5 3,5 3,5 35 1 О 75 1 0 75;рй Вязкость(мПа сек) 6,35 Израсходованный сахар, г/л Полимер, г/кгВыход/израсход.сахар (3)4в е в е в в а веа ЮКонтроль - без масла.е Ехзо 1 000 - алифатические углеволороды Вззо СЬез 1 е1 зораг И: изопарафины - Ввао СЬея 1 еСешц 1 о 1 ИР 4, НР 5, груп этоксилированные нонилФенолы - Фириы БРОЗСеза 1 зо 1 ЙЗ, АЗ 5, Т: зтоксилированные олеоцетиловые спирты Фирмы БРОЗ1 я 1 ф БрукФильд, 20 С, игла Ю 4, 30 о 6/иин,Составитель А.УльяноваТехред М.Моргентал Корректор СЯекарь Редактор Заказ 2906 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретенйям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/б Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 1011 зораг ППрирода и Сеац 1 во 1 Р 4состав ПАВ С 1 1 ру